中藥調(diào)節(jié)DNA高甲基化用藥規(guī)律的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及數(shù)據(jù)挖掘研究*

郭宵飛 李智飄 李靜靜 張 平△

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102400）

DNA甲基化是研究最深入的表觀遺傳修飾之一。它在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、抑制內(nèi)源性寄生序列活性和穩(wěn)定抑制基因表達中起關(guān)鍵作用，對基于潛在基因序列的基因活動而言，不同基因組區(qū)域的DNA甲基化可能會產(chǎn)生不同的影響［1-2］。研究表明，異常的DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。低水平及高水平的甲基化有著不同的作用，前者可激活基因的表達導(dǎo)致癌基因表達上調(diào)或?qū)е氯旧w的不穩(wěn)定性增加，后者可導(dǎo)致部分抑癌基因沉默，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險［3］。其中DNA高水平甲基化是近年來的研究熱點。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，甲基化的發(fā)生大多數(shù)是在正常衰老過程中以一種程序化的方式產(chǎn)生的，這會提高腫瘤發(fā)生的危險性［4］。DNA甲基化這一進程是可逆的［5］，因此針對DNA甲基化進行治療以降低腫瘤的發(fā)生率、改善腫瘤患者的預(yù)后等成為腫瘤治療的新思路。中藥復(fù)方的治療具有多靶點、多層次、副作用少等特點。已有研究表明，中藥在去DNA甲基化方面有著顯著的效果，如KUMAR U等［6］研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以影響DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b的轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控乳腺癌細胞DNA甲基化水平，從而抑制癌細胞生長。然而相關(guān)的報道較少，缺乏進一步的研究。本研究基于中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，將中藥、成分、靶點等層次的信息進行整合篩選，從而展現(xiàn)去DNA甲基化的藥物、成分、靶點之間的關(guān)系，為進一步探索中醫(yī)藥調(diào)節(jié)DNA甲基化水平的理論研究、新藥研發(fā)以及臨床用藥提供思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 DNA高甲基化相關(guān)作用靶點收集 登錄Gene-Cards（http：//www.genecards.org）［7］、OMIM（https：//omim.org）［8］、GenCLip 3（http：//ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）［9］等數(shù)據(jù)庫，以“DNA hypermethylation”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲得與DNA高甲基化相關(guān)靶點，并采用蛋白數(shù)據(jù)庫 UniProt（https：//www.uniprot.org/）［10］匹配各個靶點的全稱。

1.2 篩選候選化合物及構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò) 運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com）［11］收集作用于DNA高甲基化相關(guān)靶點的化合物，并以DL≥0.18為條件進行篩選，獲得DNA高甲基化相關(guān)化合物的名稱、DL值以及PubChem CID等信息。將潛在靶點、候選化合物導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)。

1.3 獲取中藥及靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TCMSP收集含有篩選得到的候選化合物的中藥，根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）［12］、《中藥學(xué)》［13］進行篩選，并進行中藥名稱規(guī)范，得到候選中藥。最后利用Cytoscape軟件構(gòu)建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的拓撲學(xué)參數(shù)篩選出核心節(jié)點。

1.4 中藥數(shù)據(jù)整理以及頻數(shù)分析 根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）、《中藥學(xué)》匹配所獲得候選中藥的性、味及歸經(jīng)等信息，利用Excel軟件進行頻數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 所獲取的作用靶點結(jié)果 見表1。通過檢索GeneCards、OMIM、GenCLip 3等數(shù)據(jù)庫共收集與DNA高甲基化相關(guān)的靶點189個，其中在TCMSP數(shù)據(jù)庫中能匹配到的化合物的靶點有47個，可關(guān)聯(lián)到化合物DL≥0.18的靶點有35個，將這35個靶點定義為潛在靶點。

表1 化合物作用于DNA高甲基化的潛在靶點

2.2 候選化合物及構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡(luò) 見圖1，表2。通過TCMSP檢索得到的潛在靶點，共獲得1 188個相關(guān)化合物。將潛在靶點與候選化合物構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由1 223個節(jié)點與1 509條邊構(gòu)成。網(wǎng)絡(luò)總節(jié)點的度值越大，提示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的樞紐性越強，調(diào)控作用越大。網(wǎng)絡(luò)中，度值最高的前3位的靶點為ESR1、PGR、CHEK1，分別與732、372、236個化合物相關(guān)；度值最高的前4位的化合物為（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯［（-）-epigallocatechin-3-gallate）］、槲皮素（quercetin）、金雀異黃酮（genistein）、木樨草素（luteolin），分別與15、15、9、8個靶點相關(guān)。選取度值≥2的候選化合物與其關(guān)聯(lián)的潛在靶點構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)，圖中菱形節(jié)點表示靶點，六角多邊形節(jié)點代表化合物，各節(jié)點的大小與度值呈正相關(guān)關(guān)系。

表2 中藥調(diào)節(jié)DNA高甲基化的潛在核心化合物（度值＞20）

圖1 DNA高甲基化相關(guān)靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)

2.3 獲取的相關(guān)中藥及構(gòu)建的靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò) 見圖2，圖3。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中匹配所獲的1 188種候選化合物，共獲得470種中藥，通過《中藥學(xué)》及2020年版中藥藥典篩選后，共收集到408味中藥。構(gòu)建化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共含1 596個節(jié)點，3 425條邊。其中度值最高的前5味中藥為甘草、丹參、沙棘、枸杞子、桑白皮，分別含有96、44、35、34、34個候選化合物。以候選化合物為橋接收集各個中藥可作用的靶點，包含靶點數(shù)目最多的前4味中藥為枇杷葉、白果、女貞子、余甘子，預(yù)測此4味中藥為干預(yù)DNA高甲基化的核心。選取度值≥4的候選化合物及度值≥10的中藥與其關(guān)聯(lián)的潛在靶點構(gòu)建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)。圖中方形的節(jié)點代表中藥，菱形的節(jié)點表示靶點，六角多邊形的節(jié)點代表化合物，節(jié)點大小與度值高低呈正相關(guān)。

圖2 相關(guān)中藥的關(guān)聯(lián)候選化合物及作用靶點（前15位）

圖3 靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)

2.4 分子對接結(jié)果 見表3，圖4。將高度值靶點PGR（PDB ID：1SQN）、CHEK1（PDB ID：2YEX）、CDKN1A（PDB ID：5E0U）、BCL2（PDB ID：6GL8）、ESR1（PDB ID：7BAA）與高度值化合物槲皮素、西托糖苷、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇分別進行分子對接。結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表示靶點與化合物有較好的結(jié)合活性。對接結(jié)果顯示，各靶點與化合物的對接結(jié)合能均＜-5.0 Kcal/mol，提示其結(jié)合活性良好。其中，β-谷甾醇與PGR的結(jié)合能最佳，為-9.3 kcal/mol，基本驗證了靶點與化合物之間有著密切關(guān)聯(lián)。將4個結(jié)合能小于-8.5 Kcal/mol的對接結(jié)果進行展示。

表3 核心潛在靶點與候選化合物分子對接結(jié)果（kcal/mol）

圖4 部分核心潛在靶點與候選化合物分子對接示意圖

2.5 候選中藥的性味與歸經(jīng)統(tǒng)計結(jié)果 見表4～表6。匹配所獲得的408種中藥的四氣、五味及歸經(jīng)信息并利用Excel進行頻數(shù)統(tǒng)計，結(jié)果顯示，可干預(yù)DNA高甲基化的中藥藥味以苦、辛、甘為主，藥性以溫、寒居多，主要歸肝、肺二經(jīng)。

表4 調(diào)節(jié)DNA高甲基化中藥的藥性分布

表5 調(diào)節(jié)DNA高甲基化中藥的藥味分布

表6 調(diào)節(jié)DNA高甲基化中藥的歸經(jīng)分布

3 討論

DNA甲基化是影響基因活動的主要表觀遺傳因素之一。DNA甲基化大多數(shù)發(fā)生在CpG位點之前的胞嘧啶或鳥嘌呤核苷酸上，不同區(qū)域的DNA甲基化可能對基因活動產(chǎn)生不同的影響［1］。DNA高甲基化對于癌癥的發(fā)生發(fā)展有著一定的影響，有研究發(fā)現(xiàn)減少小鼠模型中的甲基化也被證明可以在特定情況下預(yù)防癌癥形成。另外，眾多研究發(fā)現(xiàn)基因高甲基化與腫瘤治療反應(yīng)差有關(guān)［14］。隨著DNA甲基化作為新的癌癥篩查指標以及治療作用靶點的廣泛應(yīng)用，中藥干預(yù)DNA高甲基化的研究開始進入科研人員及臨床醫(yī)師的視線，探索可干預(yù)DNA高甲基化的中藥單藥或復(fù)方對臨床治療和新藥的研發(fā)具有重要意義。本次研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，基于多個數(shù)據(jù)庫，以DNA高甲基化相關(guān)靶點作為切入點，匹配出相關(guān)的化合物及中藥，構(gòu)建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)，對中藥干預(yù)DNA高甲基化的物質(zhì)基礎(chǔ)以及用藥規(guī)律進行了較為系統(tǒng)的分析預(yù)測。

根據(jù)靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)，度值最高的化合物有β-谷甾醇、槲皮素、西托糖苷、豆甾醇、山柰酚等。槲皮素是黃酮類化合物中黃酮醇類的重要黃酮類化合物之一，既往研究表明，槲皮素具有通過表觀遺傳控制機制發(fā)揮部分抗癌作用的能力，它能以濃度依賴的方式抑制部分DNA甲基化［15］。Tan S等通過研究證明槲皮素可以通過誘導(dǎo)CDKN2A基因啟動子去甲基化并在80 mM濃度下增強基因表達從而抑制人結(jié)腸癌細胞的生長［16］。山柰酚抗腫瘤活性的假設(shè)作用機制包括阻斷細胞周期進程、誘導(dǎo)凋亡、抑制環(huán)氧化酶-2等［17］。調(diào)控DNA甲基化也是其作用機制之一。Wei Qiu等通過使用山柰酚治療膀胱癌裸鼠發(fā)現(xiàn)山柰酚調(diào)節(jié)了膀胱癌中的DNA甲基化，誘導(dǎo)了多個與基因相關(guān)的差異DNA甲基化位置，并觀察到山柰酚特異性抑制DNMT3B的蛋白質(zhì)水平，而不改變DNMT1或DNMT3A的表達［18］。槲皮素及山柰酚都是黃酮類化合物，兩者存在于許多水果和蔬菜中，可為DNA高甲基化的食療提供方向和理論依據(jù)。

通過篩選所獲得的中藥中，干預(yù)DNA甲基化靶點數(shù)目最多的前4味中藥為枇杷葉、白果、女貞子、余甘子。枇杷葉、白果、女貞子、余甘子均含有黃酮類成分，黃酮類化合物中擁有一個黃烷核，研究發(fā)現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來抑制DNA甲基化［19］，這或許是4味中藥干預(yù)DNA高甲基化的機制之一。有研究表明，女貞子表現(xiàn)出對p16基因表達的促進作用以及去甲基化作用，從而抑制腫瘤細胞的增殖［20］。其余中藥干預(yù)DNA高甲基化的相關(guān)報道較少，有待進一步研究。

根據(jù)頻數(shù)分析顯示，干預(yù)DNA高甲基化的中藥藥味以苦、辛、甘為主，藥性以溫、寒居多。其主要歸經(jīng)為肝、肺二經(jīng)，臟病多虛，故以甘味補之。辛味能散能行，苦味能瀉能燥，二者一通一降，開泄并用，可行氣、去熱、化痰，加以甘味防止疏泄太過。肝主疏泄、主藏血，主升主動，肺主氣，主行水，朝百脈，二者一升一降，推動全身氣血運行。DNA高甲基化以抑制抑癌基因的激活為機制之一，肝肺推動氣血的運行或許是調(diào)控這一機制的重要方式。臨床用藥應(yīng)可以行氣活血、補益和中、祛寒清熱為主，疏肝理肺。

隨著人們對于DNA甲基化研究的進展，以DNA甲基化為靶點的治療方法正不斷被提出。中藥治療疾病有著多靶點、多通路并且耐藥性低的特點，在干預(yù)DNA高甲基化方面有著獨特優(yōu)勢，但目前關(guān)于中藥對DNA去甲基化作用的研究多局限于中藥提取物，難以發(fā)揮中醫(yī)藥復(fù)方整體治療的特點。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，以DNA高甲基化相關(guān)靶點為切入點，系統(tǒng)探討了中藥干預(yù)DNA高甲基化的物質(zhì)基礎(chǔ)及用藥規(guī)律，為中藥干預(yù)DNA高甲基化的研究以及臨床用藥提供了一定的借鑒。本研究的數(shù)據(jù)主要從網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫收錄獲得，借助網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法，只能顯示靶點、化合物、中藥之間的關(guān)系數(shù)量，未能兼顧不同人群、腫瘤類型等因素所帶來的影響，具有一定局限性，故研究結(jié)果仍需進一步實驗驗證。