Wnt/β-catenin信號調節對毛囊干細胞定向分化的影響

周汝楠，段明玥，王一碩，羅皓文，陳夢怡，閆佳樂，陳 杰

（1.西安醫學院第二臨床醫學院麻醉系，陜西 西安 710000；2.西安醫學院第二附屬醫院醫療美容科，陜西 西安 710000）

毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSC）的發現和體外培養方法的發展為燒傷皮膚的組織工程治療提供了可能[1]。HFSC是一種多能干細胞，具有多向分化潛能[2]。HFSC的增殖和分化能力都受自身基因和外界信號的影響。研究證實[3，4]，Wnt/β-catenin信號通路在毛囊的發育過程中起著至關重要的作用，Wnt是胚胎毛囊發育過程中最早表達的信號分子，Wnt蛋白與其受體結合可激活Wnt/β-catenin信號通路，導致β-catenin在細胞質中積聚，β-catenin與淋巴增強因子-1（LEF1）結合可激活靶基因，加速HFSC的定向分化[5]。化學物質（如LiCl）和角質形成細胞生長因子（KGF）也可導致HFSC分化，但具體機制尚不明確。本研究旨在探討角質形成細胞生長因子（KGF）和LiCl在毛囊干細胞分化過程中對Wnt/β-catenin信號通路功能的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織收獲與細胞分離 無菌條件下取新鮮人頭皮標本，用含5%青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）反復沖洗；去除皮下脂肪組織和雜質后，將皮膚切成4 mm×2 mm的小塊，放入含有0.25%分散酶的離心管中，4 ℃下消化過夜；然后沿毛發生長方向輕輕拔出毛囊，用PBS洗滌去除皮下油脂，加入60 mmol/L培養皿中，添加含10%胎牛血清（FBS）DMEM培養基（HyClone）；用2.5 g/L胰蛋白酶和0.04% EDTA在37 ℃下孵育10 min，分離毛囊隆起區，然后以5×107個/L的密度離心再懸浮于K-SFM培養液，細胞在37 ℃、5% CO2的加濕箱中孵育。每隔3～4 d更換培養液1次，培養傳代3次后用于所有實驗。

1.2 LiCl和KGF的處理及各蛋白檢測方法 將HFSC懸浮于K-SFM培養基（不含胎牛血清）中，以1×105個/ml的濃度接種于100 mmol/L培養皿中。然后將10 mmol/L LiCl或10 μg/L KGF濃度加入培養基中，逆轉錄聚合酶鏈反應檢測培養3、5、7、9 d后腺瘤性大腸息肉（APC）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β)、軸蛋白（Axin）及淋巴增強因子1（LEF1）mRNA的表達。未治療組作為對照組。

2 結果

2.1 HFSC生長特性 毛囊突起的原代細胞呈橢圓形，體積小，大小均勻，活細胞光學透明，邊界清晰，可見一簇簇未分離的細胞。培養初期細胞黏附和活性較弱，培養1～3 d后觀察到少數HFSC貼壁，多數仍保持懸浮狀態（圖1A、圖1B）；培養4～6 d后培養皿上附著少量單個細胞或細胞團，呈鵝卵石狀，排列整齊，折射率高。細胞數量隨著培養時間的增加而增加（圖1C、圖1D）；培養2周后，可觀察到一些老化的細胞。

圖1 HFSC的原代培養情況（×40）

2.2 LiCl及KGF對Wnt/β-catenin信號通路組分基因表達的影響 經10 mmol/L LiCl處理后，β-catenin、APC及LEF1 mRNA表達逐漸升高，Axin和GSK-3β mRNA表達逐漸降低（圖2）；經10 μg/L KGF處理后，β-catenin mRNA相對表達量沒有明顯改變，但GSK-3β和LEF1 mRNA的表達逐漸下降（圖3）。

圖2 10 mmol/L LiCl對β-catenin、APC、GSK-3β、Axin及LEF1 mRNA表達的影響

圖3 10 μg/L KGF對β-catenin、APC、GSK-3β、Axin及LEF1 mRNA表達的影響

3 討論

HFSC是在人的毛囊外根鞘隆突部中的一種，屬于成體干細胞，在體內處于靜止狀態，在體外培養作用下具有較強的增殖能力。研究發現[6]，HFSC具有多向分化潛能，可分化成表皮、毛囊、皮脂腺，參與皮膚創傷愈合的過程。影響毛囊干細胞增殖和分化的主要內在調控因子是Wnt、β-catenin和Notch和Exit domain A信號通路，外在信號主要包括有絲分裂原、細胞間相互作用、堿性成纖維細胞生長因子或表皮生長因子等細胞生長因子[7，8]，此外，部分化學物質（如LiCl）等信號構成了HFSC增殖分化的外部微環境。KGF是成纖維細胞生長因子（FGF）超家族的成員，可調節各種細胞類型的增殖和分化。當皮膚受損時，基質細胞中KGF的表達急劇上調，促進HFSC的增殖[9]。本研究從毛囊隆起中分離出HFSC，探討10 mmol/L LiCl、10 μg/L KGF對HFSC分化的影響。

本研究結果顯示，經10 mmol/L LiCl處理后，β-catenin、APC及LEF1 mRNA表達逐漸升高，Axin和GSK-3β mRNA表達逐漸降低。分析認為，LiCl作為關鍵的Wnt信號激動劑，可抑制GSK-3β的活性。絲氨酸-9處的GSK-3磷酸化可阻止GSK-3β降解β-catenin，從而上調β-catenin的表達。β-catenin的表達與β-catenin-Axin-Apc-GSK-3β復合物呈正相關，而與GSK-3β和Axin水平呈負相關。Axin是Wnt信號通路的關鍵負調控因子，是β-catenin降解復合物的關鍵成分，具有多個蛋白質相互作用結構域，在各種蛋白質復合體中起支架蛋白的作用[10-12]。Axin使GSK-3β接近β-catenin，并調節磷酸化β-catenin的降解。本研究表明，LiCl可抑制GSK-3β mRNA的表達，從而抑制軸蛋白復合體的形成，從而間接上調β-catenin的水平。LEF1是Wnt信號通路中的重要轉錄因子，該基因編碼的蛋白質可以與T細胞受體α增強子中的功能重要位點結合，可能在毛細胞分化和毛囊形態發生中發揮作用。LiCl處理使β-catenin和LEF1 mRNA水平隨培養時間的延長而升高，可能是由于β-catenin復合體與LEF1的蛋白水平升高所致。在10 μg/L KGF處理的細胞中，隨著HFSC的分化，β-catenin的表達在第7天略有增加，而GSK-3β的表達略有下降，LEF1水平在早期即下降，顯示角質細胞生長因子的干預作用與GSK-3β對Wnt/β-catenin途徑由活化轉為抑制的過程尚未明確，但說明KGF與LEF1呈負相關，在初始階段可抑制毛囊分化與形成[13-16]。

綜上所述，分離培養的毛囊干細胞在體外經多次傳代后仍具有一定的增殖能力和多向分化潛能。LiCl與KGF均可激活Wnt/β-catenin信號通路，改變β-catenin的表達，進而促進毛囊干細胞分化。