煤氣化廢水馴化后硝化菌群的脫氨性能及群落分析

方玉美，程順利，黃玉喜，彭子涵，赫玲玲，肖進彬

（河南省高新技術實業有限公司，河南 鄭州 450002）

0 引言

煤氣化廢水是含芳香族化合物和雜環化合物的典型廢水，主要來源于煤氣發生爐的煤氣洗滌、冷凝及凈化等過程中。煤氣化廢水成分復雜，含有殘留的焦油、酚和氨等污染物和其他物質，COD 濃度高，一般呈深褐色，有一定粘度，多泡沫，有濃烈的酚、氨臭味[1-3]。我國在“十二五”，“十三五”，“十四五”生態環境保護規劃中，明確了NH4+-N，TN 為國家水體污染約束性控制指標，因此煤氣化廢水的NH4+-N 脫除問題一直是關注的熱點。

近年來，相比磷酸銨鎂沉淀法、蒸氨法、催化電解法等工藝，生物脫氮法因其操作簡便、低成本效益高等優點被廣泛應用于廢水脫氮處理[4-5]，其中短程硝化反硝化、厭氧氨氧化脫氮工藝已逐漸發展成為一種趨勢。但傳統硝化細菌生長緩慢，平均代時均在10 h 以上，且受外界環境，如pH 值、溫度、微生物種類等影響較大[6-7]，同時煤氣化廢水作為處理難度較大的工業廢水之一，COD 質量濃度在2 000 mg/L 以上，NH4+-N 質量濃度在200 mg/L 以上[1]，若 利用一般硝化菌劑處理高濃度NH4+-N 煤氣化廢水，且考慮廢水中有毒有害有機物對微生物菌群的不利影響，出水中NH4+-N 和TN 濃度易出現不達標現象。研究在工業煤氣化廢水環境中，利用活性污泥曝氣馴化硝化菌液，期望獲得耐受高濃度NH4+-N 的耐毒硝化菌液[8-9]，進一步為硝化菌劑應用于煤氣化廢水的工業化處理提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

試劑：（NH4）2SO4，KH2PO4，Na2HPO4，NaHCO3，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O（NaCO3為分析純，Fe-EDTA 為化學純）。

儀器：TU-1810 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；水質指標快速檢測儀（鄭州沃特測試技術有限公司）；LHZ-111A 全溫振蕩器（上海程捷儀器設備有限公司）；PHS-3E pH 計和DO-957 溶解氧測定儀（上海雷磁儀器有限公司）。

用于馴化硝化菌液的污泥取自甲胺污水處理廠的活性污泥；煤氣化廢水取自河南某化工廠煤氣洗滌污水。原水水質指標見表1。mg·L-1

表1 煤氣化廢水原水水質指標

對照組菌劑為市售硝化菌劑（適用于各類含NH4+-N 廢水的處理）；實驗組菌劑為煤氣化廢水連續培養裝置曝氣池中的硝化菌液。

硝化菌培養基和脫氨能力測試培養基：(NH4)2SO4，KH2PO4，Na2HPO4，NaHCO3，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，Fe-EDTA 質量濃度分別為2.5，0.7，13.5，0.5，0.1，0.005，0.001 g/L。

pH 值調節液：Na2CO3溶液（質量分數為5%）。

1.2 方法

1.2.1 硝化菌液的馴化與富集

以甲胺污水處理廠的活性污泥為接種物，接種體積分數為30%，在連續培養裝置中加入質量分數為10%～15%的煤氣化廢水曝氣馴化培養，使曝氣池NH4+-N 質量濃度維持在300 ～500 mg/L，DO 質量濃度維持在2 ～5 mg/L，pH 值為6 ～9，馴化時間6個月。取適量馴化后的廢水樣品接入到100 mL 硝化菌培養基中進行硝化菌液的富集培養，培養時間15 d，溫度30 ℃，轉速150 r/min，連續培養3 代后收集菌種。

1.2.2 硝化菌液氨態氮脫除能力測試

共設3 組處理組：對照組1 和對照組2 分別為不同市售菌劑，試驗組為馴化后的硝化菌液。設計NH4+-N 初始質量濃度為450 mg/L，配制脫氨能力測試培養基，按菌數量1.0×106cfu/mL 接種，在30 ℃，搖床轉速150 r/min 條件下培養20 d，通過檢測NH4+-N 濃度的變化考察硝化菌液脫除能力。

1.2.3 不同pH 值對硝化菌NH4+-N 轉化的影響

設計NH4+-N 初始質量濃度為450 mg/L，培養過程中調節pH 值分別為7.0，7.5，8.0，8.5，通過檢測NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的濃度考察馴化后硝化菌液的適宜NH4+-N 轉化的pH 環境及3 種價態氮的轉化規律。

1.2.4 處理時間對硝化菌液氨態氮轉化的影響

設計NH4+-N 初始質量濃度為450 mg/L，調節培養液pH 值為8.0，通過檢測NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的濃度考察馴化后硝化菌液的脫除NH4+-N適宜的pH 值及3 種價態氮的轉化規律。

1.2.5 溫度對硝化菌液氨態氮轉化的影響

設計NH4+-N 初始質量濃度為450 mg/L，在25，30，35 ℃溫度條件培養，通過檢測NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的濃度考察馴化后硝化菌液的適宜NH4+-N轉化的溫度及3 種價態氮的轉化規律。

1.2.6 馴化后硝化菌液的微生物多樣性分析

取馴化前后的水樣作為樣品送至戊碳糖生物檢測，采用16SrRNA 基因文庫高通量測序、alpha 多樣性分析馴化后硝化菌液的優勢菌屬及相對豐度。

1.2.7 水質指標測定方法

NH4+-N 采用HJ 535—2009 納氏試劑分光光度法；NO3--N 采用GB 7480—87 酚二磺酸分光光度法；NO2--N 采用GB 7493—87 分光光度法；pH 值采用玻璃電極及精密pH 試紙法檢測。

1.2.8 數據處理與分析

式中：N0為NH4+-N 初始質量濃度，mg/L；Nx為培養x天后的NH4+-N 質量濃度，mg/L。

式中：B0表示NO2--N 初始質量濃度，mg/L；Bx表示培養x天后的NO2--N 質量濃度，mg/L。

式中：C0表示NO3--N 初始質量濃度，mg/L；Cx表示培養x天后的NO3--N 質量濃度，mg/L。

相關數據分析采用Origin92 軟件處理完成。

2 結果與分析

2.1 硝化菌NH4+-N 脫除能力測試

考察馴化后的硝化菌液對NH4+-N 的脫除能力，結果見圖1。

圖1 不同來源的硝化菌對NH4+-N 的去除效果

由圖1 可知，培養20 d 后，對照組1 的NH4+-N質量濃度降至402.65 mg/L，NH4+-N 去除率為9.4%；對照組2 的NH4+-N 質量濃度降至385.21mg/L，NH4+-N 去除率為13.3%；實驗組的NH4+-N 質量濃度降至140.96 mg/L，NH4+-N 去除率為68.78%。對比采購的2 種市售菌劑，在NH4+-N 初始質量濃度為450 mg/L 時，馴化后的硝化菌液具有顯著優勢。

2.2 pH 值對硝化菌液NH4+-N 轉化的影響

不同pH 值條件下NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的轉化規律見圖2。由圖2 可知，培養12 d 后，在pH值為7.0 時，NH4+-N 質量濃度降至186.3 mg/L，去除率為58.6%；NO2--N 質量濃度為226.9 mg/L，積累率為50.43%；NO3--N 質量濃度為25.6 mg/L，積累率為5.68%。在pH 值為7.5 時，NH4+-N 質量濃度降至18.9 mg/L，去除率為95.8%；NO2--N 質量濃度為224.0 mg/L，積累率為49.79%，NO3--N 質量濃度為25.1 mg/L，積累率為5.57%。在pH 值為8.0 時，NH4+-N 質量濃度低于檢測限（0.1 mg/L）；NO2--N 質量濃度為210.4 mg/L，積累率為46.76%；NO3--N 質量濃度為24.7 mg/L，積累率為5.50%。在pH 值為8.5 時，NH4+-N 濃度降至46.75 mg/L，去除率為89.61%；NO2--N 質量濃度為215.9 mg/L，積累率為47.98%；NO3--N 質量濃度為25.0 mg/L，積累率為5.56%。從實驗數據來看，經煤氣化廢水馴化的硝化菌液在pH 值為7.5 ～8.5 環境下，NH4+-N 去除率均超過80%。

圖2 NH4+-N，NO2--N，NO3--N 的質量濃度變化

2.3 處理時間對硝化菌液NH4+-N 轉化的影響

考察14 d 內NH4+-N 的轉化規律，結果見圖3。

圖3 NH4+-N，NO2--N，NO3--N 轉化曲線

由圖3 可知，經煤氣化廢水馴化的硝化菌液在第2 天開始起效，14 d 內將質量濃度為450 mg/L 的NH4+-N 全部轉化。NO2--N 質量濃度在第7 天達到峰值（221.73 mg/L），之后的7 d 內NO2--N 濃度達到動態平衡；NO3--N 質量濃度在第7 天達到峰值25.0 mg/L，之后的7 d 內NO3--N 濃度達到動態平衡。第7天后，NH4+-N 繼續減少，但NO2--N 和NO3--N 均未檢測到明顯增加，分析原因為除部分無機氮被微生物自身生長利用外，可能存在某類好氧反硝化菌，將NO2--N 和NO3--N 還原為N2脫除，維持NO2--N 和NO3--N 的動態平衡。

2.4 溫度對硝化菌液NH4+-N 轉化的影響

考察不同溫度條件下3 種價態氮的轉化規律，結果見圖4。

圖4 不同溫度條件下NH4+-N，NO2--N，NO3--N的轉化規律

由圖4 可知，NH4+-N 在30 ℃環境下脫除效率較高，培養8 d 后，NH4+-N 質量濃度降至10 mg/L 以下；在35 ℃環境下，NH4+-N 的脫除效率優于25℃時的脫除效率，由此可推測，硝化菌液中氨氧化菌的適宜溫度為30 ℃左右；在30 和35 ℃環境下，NO2--N的積累量相差不大，25 ℃環境下NO2--N 的積累量稍低，推測亞硝化菌在30 ～35 ℃生長狀態良好；由于硝化細菌的代時較長，在培養至14 天時，NO3--N積累量變化仍較小，表明該菌群中硝化細菌生長緩慢，倍增時間長達十幾天。

2.5 微生物多樣性及群落結構組成分析

通過2 組樣品16SrRNA 基因文庫高通量測序，經煤氣化廢水馴化后的樣品（NF1）與馴化前的樣品（NF2）alpha 多樣性指標計算結果見表2。

表2 alpha 多樣性指標計算結果

由表2 可知，2 個樣品的文庫覆蓋率均大于0.98，表明測序深度已經基本覆蓋樣本中的所有物種。NF1 的Chao1和ACE指數均大于NF2，因此，NF1 具有較大的OTU 數，即馴化后的樣品物種豐富度大于馴化前的樣品，具有較多的物種總數。而NF2的Shannon多樣性指數和Simpson多樣性指數大于NF1，說明馴化前樣品群落多樣性高于馴化后的樣品。多樣性指數較高的原始污泥群落各種之間分配較均勻，而馴化后的樣品各種之間生物差異較大，優勢種群明顯。

群落分部情況見圖5，優勢菌屬中優勢菌株的占比見表3。由圖5 及表3 可知，馴化前樣品菌群分布均勻，稍有優勢的前3 類菌群為：甲基菌屬（Methylobacillus），申氏菌屬（Shinella），短鏈單胞菌（Brevundimonas）。馴化后的樣品中優勢菌群明顯，前4 類優勢菌種為：螺桿菌（Helicobacter），亞硝化單胞菌（Nitrosomonas），硝基黃桿菌（Diaphorobacter），假單胞菌屬（Pseudomonas）。檢測到的Nitrosomonas菌種主要為歐洲亞硝化單胞菌（Nitrosomonas europaeaATCC 19718），在檢測樣品的中相對豐度為21.76%；Diaphorobacter屬主要為嗜酸菌（Acidovorax ebreus），相對豐度為5.89%，假單胞菌（Pseudomonas）主要為Pseudomonassp.SGb396，相對豐度為4.62%。

圖5 樣品在屬層次的群落結構（前10 種）

表3 優勢菌屬中優勢菌株的占比

3 討論

試驗結果初步表明，馴化后的硝化菌液在pH值為8.0，溫度為30 ℃條件下，具有較強的氨氧化能力，這與報道文獻中氨氧化細菌的較適pH 值、溫度條件一致[10-11]。目前已報道的氨氧化菌的較適pH 值多數為偏堿性，當pH 值降低時，NH3將轉化為NH4+，影響氨氧化菌（AOB）底物NH3的獲得，從而影響氨氧化細菌豐度甚至種類[12]。在氧化脫氨過程中需補加堿液維持pH 環境，提高菌群的氨氧化速率和脫氨效率。從3 種價態氮的轉化規律來看，馴化后硝化菌液中氨氧化能力較強，硝化能力偏弱，具有短程硝化的應用潛能。

在污水處理中硝化細菌作為功能菌群，其種類和數量決定了污水中NH4+-N 及其它污染物的降解程度。受處理水質的影響，馴化前活性污泥樣品中Methylobacillus，Shinella，Brevundimonas3 種菌屬相對豐度較大，其中Shinella具有脫除NH4+-N、降解酚類的功能[13-15]。馴化后樣品中優勢菌群與馴化前相差較大，前4 類優勢菌種為螺桿菌（Helicobacter），亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas），硝基黃桿菌（Diaphorobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。其中螺桿菌屬是污水中常見菌群[16]；亞硝化單胞菌屬的菌種主要是歐洲亞硝化單胞菌（Nitrosomonas europaea ATCC19718），是一種自養氨氧化菌，具有將NH4+-N 轉化成NO2--N 的功能[17]，是短程硝化的主要菌種；硝基黃桿菌屬中優勢菌種為Acidovoraxebreus，張念鑫等[18]研究發現嗜酸菌（Acidovoraxebreus）既可利用有機氮又可利用無機氮；硝基黃桿菌屬具有異養反硝化、降解酚和烴的功能，寇悅等[19]將Diaphorobacter稱為酚降解菌，RITIGALA 等[21]檢測到Diaphorobacter屬在反硝化中占優勢[20-21]，WANG P 等[22]檢測到Diaphorobacter以多環芳烴為唯一碳源，具有多環芳烴生物修復作用，劉攀龍[23]檢測到Diaphorobacter nitroreducens有氨態氮脫除功能；假單胞菌是一種常見的反硝化細菌，同時還具有有氧反硝化以及反硝化吸磷的功能，假單胞菌中有關Pseudomonas sp.SGb396 菌種的報道較少，但其同類菌株有研究報道，ZHANG D 等[24]研究發現假單胞菌屬Pseudomonas sp.Y39-6 具有好氧-異氧反硝化功能，HENTATI 等[25]檢測到銅綠假單胞菌NAPH6具有降解萘，脂肪烴等功能。綜上所述，經過煤氣化廢水馴化后，一些適應該廢水水質的微生物被富集，氨氧化菌、酚烴類降解的菌成為優勢菌群。異養反硝化菌的存在更好地解釋了結果2.3 中存在的氮素部分消失現象。

對于較高NH4+-N 濃度的廢水，尤其是工業廢水，由于污水中毒害物質對微生物的抑制作用，加上硝化菌群的繁殖代時長，硝化菌劑直接加入污水處理系統，往往存在起效慢，效果不理想的情況。經實際廢水馴化培養后，優勢菌群的相對豐度會有所改變，耐受性強的適應水質的微生物菌群得到富集成為優勢菌群，再作為菌種加入相應的污水處理系統中能夠較快適應水質，獲得較理想的效果。

4 結論

（1）在較高NH4+-N 濃度環境下，經過煤氣化廢水馴化后的硝化菌液較市售硝化菌劑有較優的脫氨性能。

（2）經過煤氣化廢水馴化后硝化菌液的氨氧化能力較強，硝化能力相對較弱，在NH4+-N 初始質量濃度為450 mg/L，pH 值為8.0，30 ℃條件下，反應14 d 后，NH4+-N 去除率可達100%，NO2--N 積累率為50%，NO3--N 積累率為5.5%。

（3）煤氣化廢水馴化后的硝化菌液通過16SrRNA基因文庫高通量測序分析，得出馴化后樣品的優勢菌 群 為Nitrosomonas，Diaphorobacter，Pseudomonas；經過煤氣化廢水馴化培養后，一些有利于氨態氮轉化、酚類降解的菌群得到富集。