轉移抑制基因KAI1負調控Wnt/β-catenin通路在抑制鼻咽癌轉移機制中的研究〔1〕

施雨南，張珊毓，周春燕，楊靜，張小軍，王金鳳，衷敬華*

(1.贛南醫學院第一臨床醫學院，江西 贛州 341000；2.贛南醫學院第一附屬醫院，江西 贛州 341000)

鼻咽癌(NPC)是常見惡性腫瘤，發病早期易轉移。目前放療是治療鼻咽癌的主要手段，但存在放療不徹底殘留局部病灶的缺陷，易復發，治療效果不佳。因此研究NPC轉移機制可從根本上改善患者預后，臨床實用價值較高。研究表明轉移抑制基因(KAI1)表達下降或缺失與腫瘤轉移具有相關性[1]。本實驗通過體外動物模型實驗，模擬KAI1基因在小鼠成瘤組織中高表達的情況，觀察KAI1基因對模型轉移能力的影響，并通過蛋白相對表達對比驗證KAI1對Wnt/β-catenin通路的負調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人鼻咽癌CNE-2Z細胞株購于上海佰曄生物科技中心；內皮祖細胞(EPCs)購于北京安鑫康科技有限公司；BALB/c-nu雌性裸鼠購于廣州銳格生物技術有限公司；過表達KAI1基因的慢病毒購于上海吉滿基因有限公司。

1.2 主要試劑

RPMI1640培養基、二甲基亞砜(DMSO)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均購于上海生工生物技術有限公司；胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液購于江蘇碧云天有限公司；新生胎牛血清、淋巴細胞分離液、6%羥乙基淀粉購于上海易勵醫療器械有限公司；甲基雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、過硫酸銨均購于美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與轉染

將人鼻咽癌CNE-2Z細胞株進行復蘇、培養、傳代、凍存。在對數生長期將人鼻咽癌CNE-2Z細胞制成細胞懸液。將過表達KAI1基因的慢病毒轉染至EPCs中，構建高表達的KAI1基因的穩轉細胞(KAI1-EPCs)。所有細胞均進行臺盼藍染色活力檢測，要求細胞活性在95%以上。

1.3.2 構建荷人鼻咽喉裸鼠轉移模型

將裸鼠按照隨機數字表法分為3組，每組30只。三組小鼠均在腋下注射CNE-2Z細胞懸液，記錄裸鼠成瘤時間。接種7 d后，于小鼠尾靜脈采用直接注射的方法進行干預，A組為空白組，B組為EPCs組，C組為KAI1實驗組。當裸鼠出現反應遲緩、活動能力減弱、進食量下降、消瘦時，立即處死解剖。取完整的腋下移植瘤、肝臟和肺組織，記錄瘤質量。肝肺組織進行固定處理后于顯微鏡下觀察肺部轉移灶，記錄轉移灶的大小和數目。

鼠肺轉移灶計數方法及標準：I級轉移灶直徑<0.15 mm，Ⅱ級轉移灶直徑為0.15～<1 mm，Ⅲ級轉移灶直徑為1～<2 mm，Ⅳ級轉移灶直徑≥2 mm。總轉移灶數=I級轉移灶數+Ⅱ級轉移灶數×2+Ⅲ級轉移灶數×3+Ⅳ級轉移灶數×4。

1.3.3 KAI1負調控Wnt/β-catenin通路的驗證

抽取三組腫瘤細胞總蛋白，利用蛋白質印跡法(Western Blot)對三組Wnt-1和β-catenin蛋白相對表達水平進行檢測，驗證KAI1對Wnt/β-catenin通路有調控作用。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 成瘤情況

三組成瘤時間比較差異無統計學意義(P>0.05)；三組成瘤質量對比，差異有統計學意義(F=5.416，P=0.006)(見表1)。

表1 三組成瘤時間與成瘤質量比較

2.2 人鼻咽癌裸鼠移植瘤肺轉移灶的生成情況

A組13 例，B組16 例，C組3 例(見表2)。肺轉移灶計數A組為(36.21±6.82)，B組為(34.42±5.21)，C組為(14.71±2.06)，三組比較差異有統計學意義(F=164.581，P<0.001)，且C組少于A組和B組，差異有統計學意義(t=16.534，P<0.001；t=19.271，P<0.001)。

表2 三組人鼻咽癌裸鼠移植瘤肺轉移灶生成情況對比

2.3 KAI1負調控Wnt/β-catenin通路

Western Blot檢測結果顯示，三組Wnt-1表達對比差異有統計學意義(F=101.918，P<0.001)，C組表達量低于A組和B組(P<0.05)。三組β-catenin表達比較差異有統計學意義(F=44.106，P<0.001)，C組表達量明顯低于A組和B組(P<0.05)。證明KAI1可以負調控Wnt/β-catenin通路(見圖1和表3)。

圖1 三組細胞中Wnt-1和β-catenin的表達情況

表3 三組細胞中Wnt-1和β-catenin相對表達量比較

3 討 論

鼻咽癌是人類常見的頭頸部惡性腫瘤[2]，常有腫瘤轉移。目前臨床上應對腫瘤細胞轉移的方法較為匱乏，現階段鼻咽癌的主要治療手段是放化療相結合。隨著放療技術的不斷提升，患者5年生存率穩步提高[2]，但由于腫瘤的遷移特點使部分患者的預后效果不盡如人意，因此研究腫瘤的轉移機制成為人們關注的熱點[3]。KAI1是一種抑癌基因[4]，在許多腫瘤發生和發展中起重要作用。KAI1基因[5]定位于人染色體11p11.2上，編碼含有267個氨基酸的蛋白質，屬于跨膜4超家族成員，可通過細胞膜廣泛的糖基化作用、特異性定位[6]及細胞間黏附作用參與腫瘤侵襲和轉移過程[7]。

EPCs是一類在早期胚胎發育即參與血管新生的造血干細胞。研究發現循環中的EPCs可被特異吸引到腫瘤微脈管系統的“熱點部位”，參與腫瘤血管生成[8]。因此EPCs可作為腫瘤研究細胞載體用于外源基因的引入及局部表達。動物實驗腫瘤模型是指將動物建模手段和細胞生物學技術結合，將人類腫瘤模型復制到動物身上。動物實驗腫瘤模型可解決一些倫理問題和研究障礙，為研究腫瘤相關機制提供模型支持，且可實現動物模型結果與人類疾病的對比。本實驗所使用的BALB/c-nu裸鼠屬于免疫缺陷動物，缺乏成熟的T淋巴細胞，可通過取適量人癌組織細胞懸液注射的方式構建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型。

本研究構建高表達的KAI1基因穩轉細胞，通過注射法構建了人鼻咽喉裸鼠轉移模型，以觀察KAI1基因對鼻咽癌轉移的作用，衡量KAI1負調控Wnt/β-catenin通路在抑制鼻咽癌轉移機制中的作用。結果表明，C組肺轉移病灶計數明顯少于A組和B組；Western Blot檢測結果顯示，C組Wnt-1和β-catenin相對表達量均低于A組和B組。證明KAI1基因可對Wnt/β-catenin通路起到負調控作用，為臨床抑制腫瘤轉移提供理論基礎。

本實驗參考既往研究結論，驗證了KAI1基因對抑制腫瘤轉移的積極作用，并對作用機制進行探討，驗證了KAI1基因可對Wnt/β-catenin通路起負調控作用。同時本研究所使用的EPCs也為抑制腫瘤轉移的基因治療提供了參考。EPCs可躲避自然殺傷，無排斥作用和潛在致癌性，具有良好的分化、分型潛能，可作為許多基因的載體[9]，其歸巢于腫瘤微血管的特性，可被用作是鞭向運輸至腫瘤組織的基因載體[10]，為臨床應對腫瘤轉移提供新的研究靶點，為腫瘤轉移的基因治療提供理論基礎。但本實驗仍存在一定不足，未對患者臨床切片樣本中KAI1，Wnt-1，β-catenin表達量進行對比分析。