黃芩素通過BMP-2/Smad通路促進MC3T3-E1成骨作用的實驗研究

陳桂鋒 尚奇 李娟敏 陳弘林 招文華 余富勇 張鵬 余蝶 崔健超 沈耿楊* 任輝* 江曉兵*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)因其具有骨微結(jié)構(gòu)破壞，單位體積骨量減少，骨折風(fēng)險明顯增加的臨床特征，發(fā)病率逐年上升[1-2]。隨著我國人口老齡化的進展，OP已成為最常見的骨骼疾病，OP及由其所引起的骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病率仍逐年上升。因此，開發(fā)治療OP的新藥仍然迫在眉睫。

黃芩素(Baicalein，BAI)也稱為黃芩黃素。作為中藥黃芩含量最高的成分，BAI具有抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤細胞增殖與遷移、抑制病毒增殖、降低病毒活性等多項藥理活性[3-8]。已有研究表明，BAI可促進人牙周膜細胞增殖及成骨標志蛋白RUNX2和BMP-2的表達[9]；且可上調(diào)GPX4抑制小鼠MC3T3-E1成骨細胞的鐵死亡[10]；也可通過Wnt/β Catenin通路促進HCEM細胞成骨分化[11]。但目前尚未見BAI對小鼠MC3T3-E1細胞成骨分化的作用及從BMP-2/Smad通路探討B(tài)AI促進成骨作用機制的報道。因此，本研究以MC3T3-E1為研究對象，擬探究BAI通過調(diào)控BMP-2/Smad通路對MC3T3-E1成骨分化的影響及其作用機制，為BAI治療OP的應(yīng)用提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞及藥物

MC3T3-E1細胞株(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院贈送)，黃芩素(Sellleck公司，S2268)。

1.2 實驗儀器及試劑

DMEM低糖培養(yǎng)基(Servicebio公司，G4520-500)，胎牛血清(Cyagen公司，F(xiàn)BSAD-01011-500)，胰蛋白酶(Servicebio公司，G4001-100)，茜素紅染料(Cyagen公司)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen公司，MUXMT-90021)，CCK-8試劑盒(GLPBIO，GK1001)，熒光定量PCR試劑盒(TAKARA公司，RR420 L)，Trizol裂解液(美國Life Invitrogen，15596026)，EvoM-mLV反轉(zhuǎn)錄試劑(艾科瑞公司，AG11706)，RIPA裂解液(Solarbio公司 R0020)，BMP-2抗體(Abcam公司，ab14933，稀釋比例1∶1 000)，Smad1抗體(Abcam公司，ab33902，稀釋比例1∶2 000)，p-Smad1抗體(CST公司，#9516，稀釋比例1∶800)，RUNX2抗體(CST公司，#12556，稀釋比例1∶1 600)，COL1A1抗體(Affinity公司，AF7001，稀釋比例1∶500)，HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗均購自Affinity公司，CFX 96熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，DMI3000B倒置熒光顯微鏡(NIKON公司, 日本)，CO2電熱隔水式細胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)，超凈工作臺(Thermo公司, 美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)：MC3T3-E1細胞每2～3天傳代1次，完全培養(yǎng)基由10 %FBS+90 %DMEM培養(yǎng)基配制。

1.3.2藥物配制：本研究所使用的BAI通過DMSO溶解，經(jīng)PBS稀釋后加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行藥物干預(yù)。

1.3.3CCK-8檢測MC3T3-E1細胞增殖實驗：將細胞消化離心后用培養(yǎng)基重懸，并經(jīng)計數(shù)按3×104個/mL密度種入96孔板，共設(shè)置6個BAI梯度濃度，分別是0.01、0.1、1、10、100 μmol/L，每組4個復(fù)孔。分別進行藥物干預(yù)后培養(yǎng)1、3、5、7 d后棄去原培養(yǎng)基后，每孔加入110 μL含CCK-8工作液的培養(yǎng)基并孵育1 h，在酶標儀中測定吸光度。

1.3.4MC3T3-E1細胞成骨分化水平與礦化能力檢測——ALP與ARS染色：將MC3T3-E1細胞按1×104個/mL種入12孔板后。對照組用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行干預(yù)，實驗組細胞加入10 μmol/L濃度BAI進行成骨誘導(dǎo)處理，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。7 d后取出培養(yǎng)板吸出誘導(dǎo)液并沿側(cè)壁滴加PBS輕柔洗滌，加4 %多聚甲醛固定15 min后PBS洗板3次，將12孔板置于室溫中分別以堿性磷酸酶染色液(ALP)與1 %茜素紅染色液(ARS)染色0.5 h，PBS洗搖5 min，操作重復(fù)3次。染色后用掃描儀拍攝。

1.3.5MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)基因表達水平檢測——熒光實時定量PCR：①進行藥物干預(yù)后的72 h內(nèi)對MC3T3-E1細胞收集后用Trizol法提取RNA。在冰上加入1 mL/孔Trizol對6孔板細胞進行裂解，充分裂解后轉(zhuǎn)入無RNA酶EP管中，加入1/5 Trizol體積的核酸提取液上下?lián)u動后室溫靜置5 min，在4 ℃下12 000 r/min離心15 min后分次輕柔吸出上層水相，將上層水相打入新EP管并在管中加入等量異丙醇，經(jīng)充分震蕩后靜置5 min，隨后4 ℃下12 000 r/min離心15 min，將上清液輕柔吸出后加入含DEPC H2O的75 % 乙醇洗脫管中剩余的沉淀，4 ℃下7 500 r/min離心，棄去上清，室溫下干燥10～20 min，每孔加入15 μL DEPC H2O進行溶解后測量RNA濃度，分裝并保存于-80 ℃冰箱。②將提取的RNA樣品按1 μg/20 μL體系配制反應(yīng)溶液，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。③按熒光定量PCR試劑盒說明書(TAKARA公司，RR420 L)配制，12.5 μL/孔TB GreenPremix Ex Taq(2×)，及2 μL/孔cDNA，上、下游引物各0.5 μL并參照25 μL體系配平后按SYBR法開始RT-PCR反應(yīng)程序。引物由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.3.6MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)蛋白表達水平檢測——蛋白質(zhì)印跡法(WB)：在6孔板中按每孔2～5×105個/mL細胞密度進行種板，實驗組和對照組各干預(yù)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后每孔加入等量RIPA裂解液充分裂解后，放入低溫離心機內(nèi)14 000 r/min離心后取上清棄沉淀。將樣品稀釋液加入96孔板中進行濃度測定，分析濃度加入Loading Buffer并變性蛋白。進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉30 min，加入一抗并4 ℃孵育過夜，次日洗膜后孵育對應(yīng)二抗，顯影分析。

1.3.7MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)蛋白表達水平檢測——細胞免疫熒光實驗(IF)：將細胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出，吸出培養(yǎng)液后沿培養(yǎng)板側(cè)壁滴加PBS 輕柔潤洗 2～3 次，用多聚甲醛固定30 min后PBS輕柔洗板3次，每次5 min。室溫下加入1 mL 0.3% Triton-X100進行透膜，透膜后PBS洗板，加入1 % BSA室溫下封閉1 h后PBS洗板，4 ℃下一抗孵育過夜。室溫下進行二抗避光孵育1 h后PBS洗板，進行DAPI避光染色5 min后洗板，加入抗熒光猝滅劑顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖實驗及成骨分化水平與礦化能力檢測

CCK-8檢測MC3T3-E1細胞增殖實驗：以對照組作為空白對照，BAI組加入不同濃度BAI進行干預(yù)。100、1 000 μmol/L組細胞增殖受到抑制(P<0.000 1)，而0.01、0.1、1、10 μmol/L等濃度未見細胞增殖被抑制，見圖1。

注：與Control組比較，**** P <0.0001。

BAI對MC3T3-E1細胞成骨分化水平與礦化能力檢測：將MC3T3-E1細胞種板后分組，按10 μmol/L干預(yù)并成骨誘導(dǎo)7 d后，分別進行ALP、ARS染色，發(fā)現(xiàn)BAI組的礦化結(jié)節(jié)明顯增加，見圖2。

圖2 黃芩素促進成骨分化及礦化的染色結(jié)果Fig.2 The staining results of Baicalein promoting osteoblast differentiation and mineralization

2.2 BAI對MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)基因表達水平檢測

與對照組比較，10 μmol/L BAI干預(yù)1 d后發(fā)現(xiàn)，BAI組COL1A1(P<0.001)、RUNX2(P<0.05)、OSX(P<0.05)mRNA表達水平在成骨分化中表達上升，ALP mRNA表達水平有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3A。10 μmol/L BAI干預(yù)3 d后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BAI組ALP(P<0.05)mRNA表達水平上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；RUNX2(P<0.001)表達上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3B。10 μmol/L BAI干預(yù)7 d后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，BAI組COL1A1 mRNA表達水平上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3C。

注：與Control組比較，* P <0.05，** P <0.001。

2.3 BAI對MC3T3-E1細胞BMP-2與 p-Smad1、Smad1蛋白的影響

與對照組比較，BAI組中的BMP-2表達水平上升(P<0.05)，見圖4B。經(jīng)BAI干預(yù)后MC3T3-E1的Smad1表達水平未見差異，p-Smad1表達上升。BAI實驗組p-Smad1/ Smad1表達水平較對照組增加(P<0.05)，見圖4B。

注：與Control組比較，* P <0.05。

2.4 BAI對MC3T3-E1細胞RUNX2、COL1A1蛋白表達的影響

對照組與BAI實驗組鏡下觀察均可見RUNX2、COL1A1蛋白熒光標記，見圖5A。與對照組相比，BAI組熒光強度增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖5B。

注：與Control組比較，** P <0.001。

3 討論

OP作為一種代謝性骨病，其骨量受成骨/破骨細胞介導(dǎo)的骨形成-骨吸收平衡調(diào)控，目前臨床只有通過減少骨量丟失、促進骨形成兩種方式進行治療。大多數(shù)治療OP的方法是通過抑制破骨以減少骨量丟失[2,13-15]。臨床應(yīng)用抗骨吸收藥物治療OP可提高總體生存率，但也有誘發(fā)不良反應(yīng)的風(fēng)險[2,13-14,16]。通過增加成骨細胞的數(shù)量或活性靶向骨形成被認為是一種更有吸引力的治療方法以增加骨形成和促進骨再生。因此，進一步挖掘促進成骨分化的藥物很有必要。BAI作為一種黃酮類化合物，廣泛存在于多種中藥中，與促進干細胞分化、抑制炎癥損傷、減少氧化應(yīng)激、促進腫瘤細胞凋亡關(guān)系密切。近年來已有研究發(fā)現(xiàn)BAI在成骨分化、破骨分化、腫瘤凋亡等領(lǐng)域治療效果顯著[17-20]，但BAI促進成骨分化的具體機制仍不明確。

不同濃度BAI對細胞增殖的作用略有差異。王彩瓊等[9]發(fā)現(xiàn)10 μmol/L為BAI干預(yù)人牙周膜細胞的適宜濃度且對ALP活性上調(diào)最顯著。本研究首先通過CCK-8實驗篩選BAI的干預(yù)濃度，探討B(tài)AI促進MC3T3-E1增殖的作用。CCK-8結(jié)果顯示，在0.01、0.1、1、10 μmol/L濃度下BAI對MC3T3-E1細胞增殖無影響。當(dāng)BAI濃度為100 μmol/L和1 000 μmol/L時抑制MC3T3-E1細胞增殖(P<0.000 1)。因此10 μmol/L是不影響細胞正常增殖的最大濃度，我們在后續(xù)研究使用10 μmol/L作為BAI干預(yù)MC3T3的最佳濃度。該濃度與既往文獻探討B(tài)AI對MC3T3-E1的最佳濃度結(jié)果一致[9]。

被認為是成骨分化早期標志物的ALP在骨形成和骨礦化中具有重要作用。MC3T3-E1細胞成骨分化可見ALP表達上升。本研究發(fā)現(xiàn)BAI可促進ALP活性上升與ARS深染，促進RUNX2、COL1A1、OSX成骨標志物表達。有文獻[9]報道不同濃度下BAI均可促進hPDLCs的ALP活性，其中10 μmol/L濃度BAI可明顯促進成骨相關(guān)標志物RUNX2和BMP-2的mRNA表達水平，與本研究的結(jié)果相符，表明BAI可促進MC3T3-E1的成骨分化。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)/Smad通路被認為在骨穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，如何通過激活該通路促進成骨細胞分化，進而促進骨形成以防治OP仍需探索。BMP-2/Smad通路在成骨細胞增殖和分化的作用已被充分證實[19,21-23]。BMP-2作為轉(zhuǎn)化生長因子家族中最大的糖蛋白肽之一，家族成員眾多。BMP-2作為驅(qū)動成骨分化不可或缺的生長因子，能與細胞膜受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)Smad通路，促進Smad1、5、8等轉(zhuǎn)導(dǎo)因子磷酸化，形成Smad復(fù)合物進入細胞核，促進RUNX2轉(zhuǎn)錄表達，并激活RUNX2以促進早期成骨mRNA的表達[24-25]。本課題組前期已發(fā)現(xiàn)BAI可促進成骨分化的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究了BAI對成骨相關(guān)基因與蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)BAI在成骨分化的不同時間可不同程度地上調(diào)ALP、RUNX2、COL1A1、OSX、BMP-2等成骨標志基因表達水平。BAI可上調(diào)BMP-2、p-Smad1等蛋白表達，提示BAI激活BMP-2/Smad通路可能是BAI促進MC3T3-E1成骨分化的途徑之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BAI可通過激活BMP-2/Smad通路以促進MC3T3-E1成骨分化。但本研究只基于細胞水平，存在一定的局限性，后續(xù)仍需要動物體內(nèi)實驗進一步探討并及運用基因敲除及過表達技術(shù)對其作用進行深入研究。