牛源益生性優良乳酸菌菌株的篩選

丁 媛，鄭博予，祁宏偉

吉林省農業科學院動物營養與飼料研究所，吉林公主嶺 136100

乳酸菌能夠促進動物體對營養物質的消化吸收，還能通過抑制有害菌株的生長繁殖，從而維持機體內微生物菌群的平衡，誘發機體產生免疫應答反應來增強機體自身的免疫能力。本文通過對其生理生化、耐酸、耐膽鹽等方面進行鑒定從而篩選出優勢牛源乳酸菌作為出發菌，為下一步發酵工藝條件研究、優化以及微生態制劑制備提供了優良的出發菌種。

1 材料

糞便樣品采集于吉林省公主嶺市張家街牛場健康成年牛的新鮮糞便；抑菌試驗所用菌株：致病菌菌株均由本實驗室保存；40只昆明小鼠（20±2 g）購自南京青龍山動物飼養場。

2 方法

2.1 樣品采集和處理

將牛新鮮糞便樣本稀釋涂布于MRS培養基中，37 ℃厭氧培養24 h。對單菌落進行平板劃線法純化后，放置-80 ℃冰箱備用。

2.2 疑似乳酸菌的形態及生理、生化特征鑒定

顯微鏡鏡檢觀察菌體的形態，對疑似乳酸菌進行鑒定。

2.3 疑似乳酸菌生長特性鑒定

2.3.1 菌液活化后經梯度稀釋后接種于MRS液體培養基中，置于不同溫度下培養7 d，測定OD600值。

2.3.2 使用HCl溶液和NaOH溶液將配好的MRS液體培養基調至不同pH值，接種疑似單菌落，培養7 d后，測定OD600值。

2.3.3 向MRS液體培養基中添加不同濃度的NaCl后接種菌，培養7 d，測定OD600值。

2.4 16 S rRNA 基因序列的測定與細菌鑒定

將純化后的菌液離心后送去測序。

2.5 生長曲線及產酸曲線

取1 mL活化后的菌液加入裝有100 mLMRS液體培養基的培養瓶中，分別于1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24 h時測定菌液OD600的吸光值和pH值，并倍比稀釋涂板計數。以MRS液體培養基為陰性對照。

2.6 耐受性

通過調整培養基pH、添加0.5%膽鹽以及使用特定菌測定其耐受性[1]。

3 結果

3.1 篩選

從健康肉牛的新鮮糞便中共篩選出20株疑似乳酸菌菌株，20株疑似乳酸菌菌株中桿菌共有15株、球菌共有5株，命名為Z1～Z20。

3.2 形態、生理生化特征鑒定

通過對疑似乳酸菌菌株形態以及生理生化特征上的鑒定分析最終篩選出5株菌株，分別為Z6、Z8、Z11、Z15、Z18。這5株菌株均為桿狀，且革蘭氏染色均為陽性。發酵葡萄糖產酸不產氣，并且發酵方式為同型發酵。

3.3 生長特性鑒定

對這5株植物乳桿菌在不同pH、溫度及鹽度條件下的生長特性進行測定發現，均能夠在45 ℃的條件下良好生長；4 ℃和6.5% NaCl條件下Z11、Z6和Z18均能夠生長，而其他的菌株呈現微弱生長和不生長；在pH3.0條件下，菌株Z18不生長，菌株Z11和Z15生長，菌株Z6和Z8呈現微弱生長。結合測定結果綜合分析選擇Z11進行后續試驗。

3.4 16S rRNA 基因序列測定

通過16S rRNA基因測序進行分析，并使用Mega 7.0對乳酸菌Z11進行系統進化樹的構建結果表明，乳酸菌Z11與植物乳桿菌NRRL B-14768相似度可達100%。

3.5 生長曲線測定以及產酸曲線測定

植物乳桿菌Z11在接種后數據表明，4 h時，Z11開始成對數生長，通過10 h的生長繁殖，在14 h時進入穩定期。4 h內pH趨于穩定，4 h后開始降低，培養至28 h時，pH降至3.96。

3.6 耐受性試驗

在pH3.0條件下，3 h后存活率93.79%。在0.5%膽鹽條件下，0 h菌落數6.45 lg（CFU/mL），3 h菌落數為5.54 lg（CFU/mL），存活率為86.31%。在pH3.0與0.5%膽鹽條件下，雖然植物乳桿菌Z11 3 h時菌落數與0 h相比均為下降趨勢，但0 h與3 h之間的菌落數均差異不顯著（p＞0.05）。表明Z11對酸性以及膽鹽環境均有一定的耐受性。

3.7 抑菌性試驗

由表1可知，植物乳桿菌Z11對致病菌均有抑制作用。

表1 Z11對病原菌的抑菌性能

3.8 藥物敏感性試驗

由表2可知：β1內酰胺類、四環素類、酰胺醇類、大環內酯類以及磺胺類抗生素均可抑制Z11生長。

表2 Z11藥物敏感性能

4 討論

眾所周知，自然環境中的個體與微生物之間存在著一定的密切關系才得以維持世間平衡[2]。在微生物的生長過程中，分為適應期、對數期、穩定期和衰亡期4個時間段[3]。了解菌株這4個時間段發生的時間能夠掌握對應時間內該菌株的生長狀況。李雪莉等[4]試驗結果發現有乳酸菌菌株在接種后4 h進入對數生長期，12 h后達到生長穩定期。本試驗根據對植物乳桿菌Z11生長曲線的研究發現，在4 h時植物乳桿菌Z11進入了對數生長期，經過10 h的生長繁殖，在14 h后進入了生長穩定期，細菌數較高，穩定性較好，可適用于在生產中使用。

發酵液pH能夠直觀地反映菌株的產酸能力，培養4 h后，植物乳桿菌Z11的pH開始下降，24 h時pH降至3.96，16 h后pH值趨于穩定，適合應用于微生物菌劑的制備。

Z11在pH為3.0時存活率可達93.79%，0.5%膽鹽條件下存活率可達86.31%，說明植物乳桿菌Z11對于低酸的胃環境以及膽鹽的腸道環境均有較好的抵御力。

Z11對常用的抗生素β1內酰胺類、四環素類、硝基呋喃類等常用抗生素敏感。有報道指出乳酸菌具有代替抗生素的潛在作用，原因為在其生長繁殖的過程中能夠產生大量有機酸以及抑菌物質。有機酸可以通過降低腸道pH值來改善腸道內的內環境，促進優勢菌株的生長繁殖，維持腸道內的平衡狀態，抑菌物質與酸性環境結合可以抑制多種病原性細菌的生長繁殖。本試驗中，Z11對常見病原菌的生長起到抑制作用，這可能與其產酸能力有關，但乳酸菌生長過程中產生的物質較多，是否產生抑菌物質從而導致抑制病原菌生長還需深入探究。