鈣對枳生長發育及柑橘潰瘍病抗性的影響

肖桂華，文康，韓健，郝晨星，葉蓉春，朱亦赤，蕭順元，鄧子牛，馬先鋒

鈣對枳生長發育及柑橘潰瘍病抗性的影響

肖桂華1,2,3，文康1,2,3，韓健4，郝晨星1,2,3，葉蓉春1,2,3，朱亦赤1,2,3，蕭順元1，鄧子牛1,2,3，馬先鋒1,2,3

1湖南農業大學園藝學院，長沙 410128；2園藝作物種質創新與新品種選育教育部工程研究中心，長沙 410128；3國家柑橘改良中心長沙分中心，長沙 410128；4湖南省園藝研究所，長沙 410125

【背景】柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞桿菌柑橘致病變種（subsp.，）引起的細菌性病害，可侵染枝、葉、果，危害幾乎所有的柑橘主栽品種。前期對湖南省39個柑橘園的調查結果顯示柑橘果園土壤酸化和交換性鈣缺乏嚴重，葉片中均存在鈣缺乏現象。鈣是植物所需大量元素之一，鈣缺乏會造成植物營養失衡，生長勢下降，植物免疫水平受影響。然而，鈣元素對柑橘潰瘍病抗性的影響尚不明確。【目的】分析對柑橘潰瘍病敏感的枳（）在不同鈣濃度處理下葉片注射接種后的致病差異，探討鈣在侵染枳葉片過程中的作用。【方法】采用沙培法對枳實生苗進行0、0.75、3、30 mmol·L-1鈣濃度處理，分別測定枳生長期的生物量、葉綠素a和b濃度、根系和葉片鈣元素含量、觀察根系活性氧（ROS）的產生和胼胝質沉積，并分析枳葉片接種后細胞壁合成相關基因及免疫途徑相關基因誘導表達變化特征。【結果】以3 mmol·L-1鈣處理為對照，0、0.75和30 mmol·L-1鈣處理后，枳地上部和地下部生長發育均受抑制，葉綠素a和b濃度降低；根系與葉片中的鈣含量與外源鈣施加量成正比；不同鈣濃度處理后根系中產生ROS和胼胝質沉積，在3 mmol·L-1處理時達到最大值；枳葉片接種后，隨著鈣濃度增加，葉片癥狀逐漸減輕，但的生長量無明顯差異；相較于3 mmol·L-1處理，參與細胞壁合成相關基因在0 mmol·L-1處理下受誘導先上調表達后下調表達，在30 mmol·L-1處理下受誘導上調表達，和在0 mmol·L-1處理下受誘導下調表達，在30 mmol·L-1處理下受誘導上調表達；葉片接種0、2、4、6 dpi后免疫途徑相關基因、、在30 mmol·L-1處理下受誘導表達水平高于0 和3 mmol·L-1處理。【結論】鈣缺乏和過量均會影響枳生長發育，引起葉片失綠，根系產生ROS和胼胝質沉積均有所減少。施鈣后接種，葉片表面的感病癥狀明顯減弱，但菌含量與對照無顯著差異。鈣可能通過調控細胞壁合成相關基因促使細胞壁增厚，從而抑制突破葉片表皮形成典型癥狀。

柑橘潰瘍病；柑橘黃單胞桿菌柑橘致病變種；鈣；枳；免疫

0 引言

【研究意義】柑橘潰瘍病由柑橘黃單胞桿菌柑橘致病變種（subsp.，）引起，是柑橘主要栽培品種中嚴重的細菌性病害之一，在世界范圍內造成重大經濟損失。前期調查研究顯示枳（）與柑橘主栽品種同樣易感潰瘍病，且大部分主栽品種無核，而枳的種子易獲得。因此，以枳為試驗材料研究防治柑橘潰瘍病的措施對柑橘產業健康發展具有重要意義。【前人研究進展】鈣是地殼中含量豐富的金屬元素之一，也是植物生長不可缺少的元素。盡管鈣在自然界中含量豐富，但在需鈣量高的果樹中容易出現缺鈣現象。其中柑橘園中Ca、Mg等營養元素嚴重缺乏，葉片營養元素缺乏比例分別為N 100%、K 2.6%、Ca 100%、Mg 100%、Zn 53.8%、B 64.1%；P和Mo不缺乏；Fe、Cu、Mn多數超量，少數缺乏，果實品質逐年下降[1]。缺鈣嚴重時，新梢停止生長，葉脈產生斑點，葉面卷曲失綠，影響光合作用，根尖端容易死亡，形成短粗的掃帚根，易引發根腐病等病害，從而影響根系的養分吸收能力[2]。鈣是一種不可移動的營養物質，很難從舊組織中重新動員，也很難通過韌皮部重新分配，缺鈣癥狀通常發生在發育中的組織，如嫩葉和根尖[3]。植物利用Ca2+來強化細胞壁，中和液泡陰離子，并提供脅迫保護。除細胞壁外，Ca2+還通過與磷脂的相互作用穩定細胞膜[4]。因此，鈣濃度低會削弱細胞壁，例如花粉管或根毛的細胞壁[5]。植物細胞壁可分為初生細胞壁和次生細胞壁，次生細胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。纖維素合成酶A（cellulose synthase A，CesA）催化UDP葡萄糖聚合以合成纖維素微纖維[6]。果膠是植物細胞壁的主要成分，果膠甲基酯酶（pectin methyl esterase，PME）是一種作用于果膠的酶，PME作用產生具有不同結構和功能特性的果膠，在植物生理學中具有重要作用[7]，成束狀阿拉伯半乳糖蛋白（fasciclin-like arabinogalactan protein，FLA）作為一類與細胞壁結構相關的糖蛋白，可以通過影響樹木中的細胞壁組成來調節莖的機械性能[8]。鈣除了作為細胞壁和其他細胞結構的重要組成部分外，作為植物細胞中普遍存在的信號物質也發揮著重要的作用[9]。Ca2+是一種普遍的第二信使，參與植物生長發育、非生物脅迫、生物脅迫[10]，作用于Ca2+滲透通道，導致細胞質游離Ca2+濃度短暫增加，這些Ca2+信號將外部信號轉化為多樣的細胞內生化反應[11-14]。據報道，施用外源鈣有助于植物抵抗病原菌，在鈣濃度高的營養液中培養的番茄植株對假單胞桿菌引起的青枯病抗性增強[15]；增加田間大豆植株的鈣供應也可以減少疫霉菌所造成的損失[16]；高鈣供應與誘導防御基因表達之間具有相關性[17]。為了保護自身免受各種生物壓力的傷害，植物進化出兩層免疫信號網絡來提供防御[18]，第一層為基礎防御，被稱為病原相關分子模式激發的免疫反應（pathogen-associated molecular patterns-triggered immunity，PTI），第二層為效應蛋白激發的免疫反應（effector-triggered immunity，ETI）。PTI可通過保守的病原體相關分子模式（pathogen- associated molecular pattern，PAMP）激活質膜（plasma membrane，PM）定位的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），啟動信號級聯，激活下游反應，包括細胞質Ca2+的增加、防御相關基因的表達、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和胼胝質沉積[19-20]。ROS的快速產生被稱為氧化爆發，是在病原體入侵時的一種早期誘導性植物反應，ROS介導的質膜Ca2+通道激活在植物信號轉導和發育中起重要作用[21]。NADPH氧化酶AtRbohD和AtRbohF在促進病原菌相關的ROS產生和介導ABA信號轉導方面具有雙重功能[22-23]。胼胝質除了參與植物正常生長發育，在抵抗病原菌入侵的防御反應中也發揮了重要作用[24]，胼胝質沉積在質膜和現有的細胞壁之間，形成物理防御屏障，抵御病原的攻擊[20]。【本研究切入點】前期調查發現田間柑橘葉片和果實受潰瘍病危害嚴重，通過對柑橘果實、葉片和土壤等的礦質營養元素分析，結果顯示鈣均缺乏嚴重，鈣可能是影響柑橘免疫水平的重要元素。【擬解決的關鍵問題】探明砧木枳對鈣的耐受水平和鈣對枳生長發育的影響，確定適宜枳生長的鈣濃度。解析鈣在枳葉片響應侵染中的作用，為柑橘園科學施肥提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2019年10月至2022年3月在園藝作物種質創新與新品種選育教育部工程研究中心和國家柑橘改良中心長沙分中心完成。

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 選取柑橘砧木枳的實生苗作為試驗材料。將新鮮飽滿種子用有效氯濃度為1%、pH為7的次氯酸鈉消毒液進行消毒處理，均勻平鋪于無菌毛巾上，覆蓋上無菌毛巾后置于25—30℃恒溫箱中暗培養約10 d進行催芽，選取萌發一致的幼芽，移栽至植物營養土，并放置于植物人工氣候室（溫度28℃，相對濕度80%，自然光周期）培養。30 d后選取長勢一致的幼苗移栽至珍珠巖培養基質中，置于植物人工氣候室進行培養。

1.1.2 菌系 供試菌系為本實驗室分離純化的DL509菌株（亞洲A系）。將保存于-80℃冰箱的DL509在LB固體培養基上劃線，置于28℃培養箱中培養2 d，挑取單菌落重懸于5 mL液體LB培養基中，在28℃、200 r/min的條件下振蕩培養18 h，再取1 mL菌液重懸于50 mL液體LB培養基中，在28℃、200 r/min的條件下振蕩培養12 h，4℃、5 000 r/min離心收集菌體，用無菌水重懸菌體，并將重懸液的OD600調至0.62（109CFU/mL左右），然后進行10倍梯度稀釋，選擇105CFU/mL用于葉片注射。

1.2 方法

1.2.1 鈣濃度梯度設置 用無水CaCl2配制0、0.75、3、30 mmol·L-1共4個鈣濃度梯度的溶液，濃度梯度設置以完全營養液3 mmol·L-1為基準。營養液中除鈣元素外的其他各養分的配置參照1/2 MT培養液的養分成分，CaCl2的添加則根據濃度試驗設置的鈣濃度。幼苗移栽至珍珠巖培養基質即進行不同鈣濃度營養液的處理，每處理3個重復，每個重復選取健康且生長一致的18株幼苗，每隔7 d澆灌營養液150 mL。

1.2.2 生長量測定 采集不同鈣濃度處理80 d后的葉片和根系進行拍照觀察及生物量的測定，使用格尺測量株高和根長，精確到0.01 cm。將幼苗整株洗凈，分為根、葉兩部分，吸去多余水分，分別稱量植株葉片和根系的鮮重，105℃殺青30 min后80℃烘干至恒重，分別稱量植株葉片和根系的干重。

1.2.3 葉綠素濃度測定 葉綠素濃度的測定參考李合生[25]的方法。采集不同鈣濃度處理14 d后的葉片測定葉綠素濃度，稱取剪碎葉片樣品0.1 g裝入15 ml離心管中，加入10 ml的95%乙醇后在黑暗條件下浸提24 h，期間顛倒搖晃混勻3—4次；搖勻后吸取200 μL于酶標板上利用多功能酶標儀（TECAN Infinite M200 Pro）測定470、649和665 nm波長處的吸光值（浸提液需進行避光處理）。

1.2.4 葉片和根系鈣元素含量測定 枳在珍珠巖基質中培養80 d后，采集整株枳，用錫箔紙包裹后置于105℃烘箱中殺青30 min，然后在65℃恒溫條件下烘干至恒重，分別稱量植株葉片和根系的干重。用多樣品組織研磨機（上海靜信實業發展有限公司，型號為TissueIyser-48）分別將烘干葉片和根系樣品研磨成粉末狀，分別稱取25 mg粉末于100 mL小口三角瓶中，加入體積比為4﹕1的濃硝酸與高氯酸的混合酸溶液10 mL，蓋上彎頸小漏斗，置于210℃的電熱板上消化，直至溶液表面出現白色霧氣且消化液清亮即可停止。置于室溫條件下冷卻至室溫，用2%硝酸溶液沖洗轉移至25 mL容量瓶中混勻定容，用電感耦合等離子體質譜儀（ICP-OES Optima 8300）進行鈣含量的測定。以未添加粉末樣品的消化處理為空白對照。

1.2.5 枳根系的ROS原位染色檢測 稱取3,3′-二氨基聯苯胺（3,3′-diaminobenzidine，DAB）粉末30 mg（Sigma-Aldrich，D8001-5G），置于50 mL的試管底部，加入15 μL的濃鹽酸促進粉末溶解，再加入30 mL無菌水，先用濃度為0.2 mol·L-1的HCl溶液調至pH 3.0后用0.2 mol·L-1Na2HPO4調至pH 3.8—3.9。將不同鈣濃度處理后的根系剪成長度約為1 cm的莖段，置于DAB染色液中，在水平搖床上室溫弱光條件下染色約14 h，隨后將根系莖段轉移至2 mL離心管中，加入1.5 mL脫色液（酒精﹕醋酸﹕甘油為3﹕1﹕1），置于95℃的水浴鍋中水浴脫色15 min，脫色至透明，放置于20%無菌甘油中保存備用。

1.2.6 枳根系胼胝質檢測 將不同鈣濃度處理后的根系剪成長度約為1 cm的莖段，放入2 mL的離心管中，加入酒精與醋酸體積比為3﹕1的脫色液，在水平搖床上室溫脫色，每6 h更換一次脫色液，直至完全脫色。然后使用70%酒精漂洗莖段2 h，再轉至50%酒精漂洗2 h，隨后置于無菌水中漂洗14 h，再用無菌水漂洗2—3次后置于10% NaOH溶液中，在37℃、200 r/min的條件下振蕩約2 h，無菌水漂洗5—6次，每次0.5 h，最后加入0.01%苯胺藍溶液染色14 h，并保存于50%甘油中備用。

1.2.7 葉片PTI免疫及細胞壁相關基因定量分析 不同鈣濃度處理的枳葉片接種，采集0、2、4、6 dpi（days post inoculation）的葉片樣品，用于細胞壁相關基因和PTI免疫相關基因的表達分析。

利用Promega公司的Eastep Super（LS1040）總RNA提取試劑盒提取總RNA，然后使用Vazyme公司的M-MLV（H-）Reverse Transcriptase試劑盒（9PIM170）合成cDNA。利用NCBI在線分析工具Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast/）設計檢測引物（表1），以為內參基因。選用Vazyme公司的ChamQ Universal SYBP qPCR Master Mix熒光染料，使用BIO-RAD CFX96Touch定量PCR儀進行擴增。反應體系10 μL：cDNA樣品2 μL，SYBP qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物（10 mmol·L-1）各0.2 μL，最后加ddH2O水至終體積10 μL。擴增條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，循環40次，每個樣品設置3個重復。數據分析根據2-ΔΔct法完成。

表1 PTI免疫響應相關基因及細胞壁合成相關基因的引物列表

1.3 數據統計與分析

采用Adobe Photoshop CS6、Zeiss Axio Imager 2.0、Image J軟件進行圖片處理，CFX Manager 3.1軟件進行數據分析，Excel 2016和IMB SPSS statistics 23分別進行標準偏差分析和方差分析，GraphPad Prism 5.0繪圖。

2 結果

2.1 不同鈣濃度處理下枳生長發育的差異

不同鈣濃度處理80 d后，枳地上部和地下部的生長出現差異（圖1-A、1-B）。與3 mmol·L-1相比，0、0.75、30 mmol·L-1處理時植株高度分別下降16.4%、13.8%、14.6%（圖1-C）；根系長度分別下降6.1%、3.7%、13.5%（圖1-D）；地上部鮮重和干重分別下降14.1%、5.9%、32.6%和30.9%、21.6%、19.7%（圖1-E、1-F）；地下部鮮重和干重分別下降11.8%、7.0%、31.2%和3.6%、3.3%、11.4%（圖1-G、1-H）。結果表明，鈣濃度為3 mmol·L-1時，地上部和地下部發育良好，0、0.75、30 mmol·L-1處理時均受到不同程度的抑制，其中30 mmol·L-1處理抑制效果最明顯。

A：實生苗生長發育The development of seedling；B：根系發育The development of root。C—H：采用鄧肯檢驗，柱上標有不同字母表示差異顯著（p＜0.05）。下同Duncan test, different lowercases on the bars indicate significant difference (p＜0.05). The same as below

2.2 不同鈣濃度處理下枳葉片中葉綠素濃度

測定了培養14 d后尚未黃化的枳葉片葉綠素a和b的濃度及總葉綠素濃度，與3 mmol·L-1相比較，0、0.75、30 mmol·L-1處理時葉綠素a和b的濃度分別下降23.0%、20.8%、11.0%和20.9%、20.0%、14.2%，總葉綠素濃度分別下降22.4%、20.6%、11.9%（圖2）。其中，3 mmol·L-1處理時，葉綠素a和b的濃度及總葉綠素濃度大于其他3個處理，0 mmol·L-1處理時葉綠素a和b的濃度及總葉綠素濃度最低。

2.3 不同鈣濃度處理下葉片和根系中鈣元素含量變化

不同鈣濃度處理枳80 d后，根系及葉片中鈣元素含量見圖3。隨鈣離子處理濃度的增加，植株葉片及根系中的鈣含量呈現上升的趨勢，相較于0 mmol·L-1處理，0.75、3、30 mmol·L-1處理時根系中分別增加了19.1%、58.6%、67.1%，葉片中鈣濃度分別增加了19.1%、281.6%、481.3%。結果表明，在根系和葉片中，鈣元素含量與外源鈣施加量成正比。

2.4 不同鈣濃度處理后枳葉片接種Xcc的癥狀差異

為驗證鈣在枳響應侵染中的作用，對不同鈣濃度處理的枳葉片注射接種105CFU/mL的，15 dpi的癥狀結果顯示，在0—30 mmol·L-1范圍內，隨著鈣濃度的增加，葉片表面出現的癥狀逐漸減輕（圖4-A），其中30 mmol·L-1時，葉片幾乎無癥狀，但細菌定量結果卻顯示各處理間菌量無明顯差異（圖4-B），表明單位葉面積的細胞間隙菌量是一致的，細菌在胞間隙的繁殖不受鈣濃度的影響。

圖2 不同鈣濃度處理下枳葉片的葉綠素濃度

2.5 鈣處理下Xcc入侵枳葉片過程中細胞壁合成相關基因的表達

鈣在穩定細胞壁物理結構方面有重要作用，其濃度的升高可能促進葉片細胞壁增厚，以抵御病原菌的入侵[26]。為探明高鈣處理下葉片接種后不表現典型癥狀的原因是否為高鈣引起細胞壁物理結構發生變化，分析了鈣處理下入侵枳葉片過程中細胞壁合成相關基因、和的表達（圖5），結果顯示，在0 mmol·L-1處理時，在4 dpi時上調表達、6 dpi時下調表達；和在6 dpi時下調表達；在3 mmol·L-1處理時，、和均下調表達，在30 mmol·L-1處理時，、和均上調表達。上述結果表明30 mmol·L-1鈣處理可誘導細胞壁合成相關基因的表達。

圖3 不同鈣濃度處理下枳葉片（A）和根系（B）中的鈣含量

A：接種15 d后癥狀觀察Observation of symptoms at 15 dpi；B：細菌定量分析Quantitative analysis of bacteria content

圖5 不同鈣濃度處理下接種Xcc后參與細胞壁合成相關基因的相對表達量

2.6 鈣處理枳葉片接種Xcc后免疫響應相關基因的表達

鈣在植物免疫中起著至關重要的作用，為探明高鈣能否影響枳葉片的免疫響應水平，分析了鈣處理下入侵枳葉片過程中免疫響應相關基因、、的表達（圖6），結果顯示，0 mmol·L-1處理時，表達量變化不明顯，在2—6 dpi表達量呈上升、下降、上升的趨勢，在0—6 dpi持續上調表達；3 mmol·L-1處理時，表達量變化不明顯，和在6 dpi時均顯著上調表達；30 mmol·L-1處理時，在4 dpi時上調表達，6 dpi下調表達，和在6 dpi時均顯著上調表達。上述結果表明30 mmol·L-1鈣處理枳葉片對的抗性增強。

圖6 不同鈣濃度處理下接種Xcc后免疫響應相關基因的相對表達量

2.7 鈣處理枳根系ROS的爆發及胼胝質沉積

外源鈣的施加可能引起植物ROS的爆發及胼胝質沉積。在0、30 mmol·L-1處理下，枳根系中ROS產生的兩個關鍵基因和均下調表達（圖7-C、7-D）。觀察不同鈣濃度處理枳根系中ROS的爆發和胼胝質沉積（圖7-A、7-B），3 mmol·L-1處理時枳根系維管形成層中產生ROS和胼胝質沉積達到最大值，0、30 mmol·L-1處理后產生ROS和胼胝質沉積均有所減少。結果表明適當鈣濃度會刺激枳根系產生ROS和胼胝質沉積，從而抵御病原菌的入侵。

3 討論

3.1 外源鈣影響枳的生長

前期對湖南省39個果園的調查研究顯示果園鈣缺乏現象普遍，栽培品種受柑橘潰瘍病的危害越來越嚴重。且大部分果園施肥以復合肥為主，少施鈣肥。針對湖南地區偏酸性的土壤，應重視鈣肥的施用[1]。根據本研究的結果，鈣缺乏是導致柑橘葉片易感潰瘍病的原因之一，但是過量鈣可能導致毒害，而適量鈣能有效促進植株的生長發育，增大葉面積，促進植株光合效率[27]。為了探明砧木枳對鈣的耐受水平和鈣對枳生長發育的影響，預試驗分析了不同鈣濃度梯度處理（0、0.75、1.5、3、7.5、15、30、60 mmol·L-1）對枳生長發育的影響，觀察比較結果顯示1.5和0.75 mmol·L-1處理生長差異不大，7.5、15和30 mmol·L-1處理差異也不明顯，60 mmol·L-1處理時枳在移栽兩周內死亡，因此采用0、0.75、3、30 mmol·L-1這4個鈣濃度開展研究。

A：枳根系DAB染色，比例尺：200 μm DAB staining of P. trifoliata roots, scale: 200 μm；B：枳根系的胼胝質染色，比例尺：100 μm Callose staining of P. trifoliata roots, scale: 100 μm；C、D：PtRbohD、PtRbohF相對表達量relative expression level of PtRbohD, PtRbohF；E：胼胝質沉積部位平均熒光強度Average fluorescence intensity of callose deposition site

鈣不僅能影響植物地上部分和地下部分生長發育[28]，且外源鈣噴施后可改善其營養品質[29]。本研究對施鈣前后枳地上部和地下部生長發育進行分析，結果顯示外源鈣促進枳生長發育，其中最適合枳生長的鈣濃度為3 mmol·L-1，與常用的基本培養基配方中的鈣離子濃度一致。鈣濃度過度增加對枳生長不利，這與張芳等[30]在枸骨木和南酸棗中的結果是一致的。推測鈣濃度為3 mmol·L-1時可能適用于大部分植物生長。枳作為砧木具有很多優良性狀，摸索出最適宜枳生長的鈣濃度對產業發展具有一定的指導意義。同時，在其他的柑橘種質中是否也存在類似規律是未來研究的方向。

3.2 外源鈣對葉綠素含量和元素吸收的影響

植物體內鈣的含量變化對其生長發育有較大影響[31]，缺鈣時，植株養分缺乏，影響生長發育進程，鈣過量時抑制對其他元素的吸收和利用。適量鈣能促進植物對鎂和鐵的吸收，但鈣過量會影響植物對鎂的吸收和分配，從而影響葉綠素的合成，最終對植物光合產生影響[32-33]。本研究中，枳葉片在0、0.75、30 mmol·L-1處理下，葉綠素a和b濃度降低，鈣含量的降低會影響枳葉片中葉綠素的合成，引起葉片失綠。這與楊陽等[34]在葡萄中的研究結果相似，其結果表明噴施外源鈣能有效緩解干旱對葡萄葉片光合作用的抑制。3 mmol·L-1處理時枳葉片也表現一定程度的黃化現象，這可能與枳在不同生長時期所需養分不一致有關。本研究中只探討了鈣濃度的變化對枳的影響，尚未針對不同時期枳所需其他養分進行研究。探明鈣對鎂、鉀等其他元素吸收的影響，以及這些元素在植物免疫方面的作用是未來研究的重要方向。

3.3 外源鈣對Xcc入侵過程的影響

鈣對真菌和細菌產生的細胞壁降解酶有抑制作用，較高的鈣濃度可抑制細胞壁降解酶的活性，從而抵御病菌的入侵[35]。在本研究中，枳葉片接種后，0—30 mmol·L-1鈣處理范圍內，葉片感病癥狀存在差異，且在30 mmol·L-1鈣處理下，細胞壁合成相關基因、和上調表達。鈣處理可誘導細胞壁合成相關基因的表達，可能促使葉片細胞壁增厚，從而改變葉片細胞壁物理結構，侵染難以突破細胞壁形成典型火山口癥狀。這與Langer等[36]的研究具有相似之處，其結果證實CaCl2處理可改變草莓果實的細胞壁代謝并激活防御反應。

ROS的爆發是植物產生抗性反應的重要標志之一。提高葉綠體中H2O2的含量可以提高農作物對鹽脅迫的抗性，來源于葉綠體中的ROS對植物的抗逆應答十分重要[37]。作為植物的另一道防御屏障，胼胝質是一種廣泛分布于高等植物中的-(1,3)-D-葡聚糖，除了參與植物正常生長發育，在植物防御中也發揮了重要作用[24]。Müller等[38]研究表明，過表達后在低磷中可觸發鐵積累和胼胝質在初生根分生組織和伸長區的沉積，這將根分生組織中胼胝質調節的細胞間信號與非生物信號的感知聯系起來。本研究中，鈣處理后枳根系維管組織形成層中產生ROS和胼胝質，觸發枳產生自身免疫應答反應，但缺鈣處理和高鈣處理下反而減弱甚至失去這種誘導免疫應激反應的能力，這可能與30 mmol·L-1處理時枳根系發育受到抑制有關。

可以被病原體相關分子模式（PAMP）激活，誘導絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）級聯反應，是病原體觸發免疫的標志基因[23,39]。在擬南芥、水稻和胡椒中，的表達被病原菌誘導上調并導致宿主耐藥性[40-42]。基因家族被預測為編碼具有特定生物學功能和亞細胞定位的胼胝體合成酶[43]。在本研究中，鈣處理下枳葉片接種后感病癥狀存在差異，在30 mmol·L-1處理下免疫防御基因上調表達，這與枳葉片在30 mmol·L-1鈣處理后表現對潰瘍病的抗性相吻合。

4 結論

不同濃度鈣處理后枳地上部和地下部的生長發育差異明顯，3 mmol·L-1鈣濃度處理最適合枳的生長。鈣處理后根系產生ROS和胼胝質沉積也存在差異，其中3 mmol·L-1ROS和胼胝質沉積量最多。鈣誘導細胞壁合成相關基因表達，鈣濃度增加可能會促使葉片細胞壁增厚，且高鈣處理后免疫防御基因、、上調表達，抑制突破葉表皮形成典型癥狀。未來可以在施肥中加入適量的鈣，促進柑橘的生長發育、改善其果實品質、提高免疫水平，并抑制的入侵。

[1] 趙宜波, 韓健, 楊貴兵, 龍立長, 譚振華, 李先信, 周衛軍, 鄧子牛, 馬先鋒. 湖南省甜橙主產區土壤和葉果礦質元素狀況分析. 中國南方果樹, 2020, 49(6): 27-33.

ZHAO Y B, HAN J, YANG G B, LONG L C, TAN Z H, LI X X, ZHOU W J, DENG Z N, MA X F. Analysis of soil and leaf and fruit mineral elements in main producing areas of sweet orange in Hunan Province. South China Fruits, 2020, 49(6): 27-33. (in chinese)

[2] 楊利玲, 張桂蘭. 土壤中的鈣化學與植物的鈣營養. 甘肅農業, 2006(10): 272-273.

YANG L L, ZHANG G L. Calcium chemistry in soil and calcium nutrition in plants. Gansu Agriculture, 2006(10): 272-273. (in chinese)

[3] WHITE P J, BROADLEY M R. Calcium in plants. Annals of Botany, 2003, 92(4): 487-511.

[4] HEPLER P K. Calcium: a central regulator of plant growth and development. The Plant Cell, 2005, 17(8): 2142-2155.

[5] BASCOM C S, HEPLER P K, BEZANILLA M. Interplay between ions, the cytoskeleton, and cell wall properties during tip growth. Plant physiology, 2018, 176(1): 28-40.

[6] YAMAMOTO T, NAKAMURA A, IWAI H, ISHII T, MA J F, YOKOYAMA R, NISHITANI K, SATOH S, FURUKAWA J. Effect of silicon deficiency on secondary cell wall synthesis in rice leaf. Journal of Plant Research, 2012, 125(6): 771-779.

[7] GIOVANE A, SERVILLO L, BALESTRIERI C, RAIOLA A, D’AVINO R, TAMBURRINI M, CIARDIELLO M A, CAMARDELLA L. Pectin methylesterase inhibitor. Biochimica et biophysica acta, 2004, 1696(2): 245-252.

[8] WANG H, JIANG C, WANG C, YANG Y, YANG L, GAO X, ZHANG H. Antisense expression of the fasciclin-like arabinogalactan protein FLA6 gene ininhibits expression of its homologous genes and alters stem biomechanics and cell wall composition in transgenic trees. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(5): 1291-1302.

[9] HIRSCHI K D. The calcium conundrum. Both versatile nutrient and specific signal. Plant physiology, 2004, 136(1): 2438-2442.

[10] DODD A N, KUDLA J, SANDERS D. The language of calcium signaling. Annual review of plant biology, 2010, 61: 593-620.

[11] FINKA A, CUENDET A F, MAATHUIS F J, SAIDI Y, GOLOUBINOFF P. Plasma membrane cyclic nucleotide gated calcium channels control land plant thermal sensing and acquired thermotolerance. The Plant Cell, 2012, 24(8): 3333-3348.

[12] TUNC-OZDEMIR M, TANG C, ISHKA M R, BROWN E, GROVES N R, MYERS C T, RATO C, POULSEN L R, MCDOWELL S, MILLER G, MITTLER R, HARPER J F. A cyclic nucleotide-gated channel (CNGC16) in pollen is critical for stress tolerance in pollen reproductive development. Plant physiology, 2013, 161(2): 1010-1020.

[13] TOYOTA M, SPENCER D, SAWAI-TOYOTA S, JIAQI W, ZHANG T, KOO A J, HOWE G A, GILROY S. Glutamate triggers long-distance, calcium-based plant defense signaling. Science, 2018, 361(6407): 1112-1115.

[14] JIANG Z, ZHOU X, TAO M, YUAN F, LIU L, WU F, WU X, XIANG Y, NIU Y, LIU F,. Plant cell-surface GIPC sphingolipids sense salt to trigger Ca2+influx. Nature, 2019, 572(7769): 341-346.

[15] CALDWELL D, KIM B S, IYER-PASCUZZI A S.differentially colonizes roots of resistant and susceptible tomato plants. Phytopathology, 2017, 107(5): 528-536.

[16] SUGIMOTO T, WATANABE K, YOSHIDA S, AINO M, FURIKI M, SHIONO M, MATOH T, BIGGS A R. Field application of calcium to reduce phytophthora stem rot of soybean, and calcium distribution in plants. Plant Disease, 2010, 94(7): 812-819.

[17] RAZ V, FLUHR R. Calcium requirement for ethylene-dependent responses. The Plant Cell, 1992, 4(9): 1123-1130.

[18] BOLLER T, HE S Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science, 2009, 324(5928): 742-744.

[19] MORALES J, KADOTA Y, ZIPFEL C, MOLINA A, TORRES M A. TheNADPH oxidasesanddisplay differential expression patterns and contributions during plant immunity. Journal of Experimental Botany, 2016, 67(6): 1663-1676.

[20] VOIGT C A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science, 2014, 5: 168.

[21] WOJTASZEK P. Oxidative burst: an early plant response to pathogen infection. The Biochemical journal, 1997, 322(3): 681-692.

[22] TORRES M A, ONOUCHI H, HAMADA S, MACHIDA C, HAMMOND-KOSACK K E, JONES J D. Sixhomologues of the human respiratory burst oxidase (gp91phox). The Plant journal, 1998, 14(3): 365-370.

[23] KLOTH K J, WIEGERS G L, BUSSCHER-LANGE J, VAN HAARST J C, KRUIJER W, BOUWMEESTER H J, DICKE M, JONGSMA M A. AtWRKY22 promotes susceptibility to aphids and modulates salicylic acid and jasmonic acid signalling. Journal of Experimental Botany, 2016, 67(11): 3383-3396.

[24] WANG Y, LI X F, FAN B F, ZHU C, CHEN Z X. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. International Journal of Molecular Science, 2021, 22(5): 2393.

[25] 李合生. 現代植物生理學. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2012.

LI H S. Modern Plant Physiology. 3rd ed. Beijing: Higher Education Press, 2012. (in chinese)

[26] ZHANG Q, XIE Z, ZHANG R, XU P, LIU H, YANG H, DOBLIN M S, BACIC A, LI L. Blue light regulates secondary cell wall thickening via MYC2/MYC4 activation of the-directed transcriptional network in. The Plant Cell, 2018, 30(10): 2512-2528.

[27] 張海平, 單世華, 蔡來龍, 官德義, 李毓, 莊偉建. 鈣對花生植株生長和葉片活性氧防御系統的影響. 中國油料作物學報, 2004, 26(3): 33-36.

ZHANG H P, SHAN S H, CAI L L, GUAN D Y, LI Y, ZHUANG W J. Effects of calcium on peanut plant growth and defense system of active oxygen in leaves. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2004, 26(3): 33-36. (in chinese)

[28] 任城帥, 李慧, 翁小航, 張淞著, 劉麗穎, 周永斌. 外源鈣對水曲柳生長、光合特性及水分利用效率的影響. 沈陽農業大學學報, 2020, 51(6): 663-669.

REN C S, LI H, WENG X H, ZHANG S Z, LIU L Y, ZHOU Y B. Effects of exogenous calcium on growth, photosynthetic characteristics and water use efficiency of. Journal of Shenyang Agricultural University, 2020, 51(6): 663-669. (in chinese)

[29] 姚棋, 韓天云, 梁祎, 石玉, 侯雷平, 張毅. 外源鈣和EBR處理對番茄果實品質特性的影響. 中國瓜菜, 2021, 34(10): 74-79.

YAO Q, HAN T Y, LIANG Y, SHI Y, HOU L P, ZHANG Y. Effects of exogenous calcium and EBR treatment on fruit quality characteristics of tomato. China Cucurbits and Vegetables, 2021, 34(10): 74-79. (in chinese)

[30] 張芳, 宋敏, 彭晚霞, 曾馥平, 杜虎, 胡芳, 陳莉, 蘇樑. 不同鈣濃度對兩種巖溶植物幼苗生長及其酶活性的影響. 廣西植物, 2017, 37(6): 707-715.

ZHANG F, SONG M, PENG W X, ZENG F P, DU H, HU F, CHEN L, SU L. Effects of different calcium concentrations on seedling growth and enzyme activities of two karst plant species. Guihaia, 2017, 37(6): 707-715. (in chinese)

[31] THOR K. Calcium-nutrient and messenger. Frontiers in Plant Science, 2019, 10: 440.

[32] 李敏, 吉文麗, 張恒, 李程程, 楊靜萱, 張延龍. 外源Ca2+對油用牡丹鳳丹白幼苗光合特性的影響. 西北林學院學報, 2017, 32(5): 39-45.

LI M, JI W L, ZHANG H, LI C C, YANG J X, ZHANG Y L. Effects of exogenous calcium on photosynthetic characteristics and biomass of oil‘Fengdan White’. Journal of Northwest Forestry University, 2017, 32(5): 39-45. (in chinese)

[33] 汪雷, 馬琛, 高海立, 徐濤. 鈣對半夏生理特性及光合生理的影響. 浙江理工大學學報(自然科學版), 2018, 39(4): 461-467.

WANG L, MA C, GAO H L, XU T. Effects of calcium on physiological characteristics and photosynthetic physiology of. Journal of Zhejiang Sci-Tech University (Natural Sciences), 2018, 39(4): 461-467. (in chinese)

[34] 楊陽, 王恒振, 王詠梅, 管雪強, 尹向田, 蘇玲. 噴鈣對干旱脅迫下葡萄光合作用及葉綠素熒光參數的影響. 安徽農業科學, 2017, 45(27): 62-64, 189.

YANG Y, WANG H Z, WANG Y M, GUAN X Q, YIN X T, SU L. Effects of calcium spray on photosynthesis and chlorophyll fluorescence of grape under drought stress. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2017, 45(27): 62-64, 189. (in chinese)

[35] FORAND A D, FINFROCK Y Z, LAVIER M, STOBBS J, QIN L, WANG S, KARUNAKARAN C, WEI Y, GHOSH S, TANINO K K. With a little help from my cell wall: Structural modifications in pectin may play a role to overcome both dehydration stress and fungal pathogens. Plants, 2022, 11(3): 385.

[36] LANGER S E, MARINA M, BURGOS J L, MARTíNEZ G A, CIVELLO P M, VILLARREAL N M. Calcium chloride treatment modifies cell wall metabolism and activates defense responses in strawberry fruit (×, Duch). Journal of the Science of Food and Agriculture, 2019, 99(8): 4003-4010.

[37] ZHUANG Y, WEI M, LING C, LIU Y, AMIN A K, LI P, LI P, HU X, BAO H, HUO H, SMALLE J, WANG S. EGY3 mediates chloroplastic ROS homeostasis and promotes retrograde signaling in response to salt stress in. Cell Reports, 2021, 36(2): 109384.

[38] MüLLER J, TOEV T, HEISTERS M, TELLER J, MOORE K L, HAUSE G, DINESH D C, BüRSTENBINDER K, ABEL S. Iron-dependent callose deposition adjusts root meristem maintenance to phosphate availability. Developmental cell, 2015, 33(2): 216-230.

[39] RASMUSSEN M W, ROUX M, PETERSEN M, MUNDY J. MAP kinase cascades ininnate immunity. Frontiers in Plant Sciences, 2012, 3: 169.

[40] ABBRUSCATO P, NEPUSZ T, MIZZI L, DEL CORVO M, MORANDINI P, FUMASONI I, MICHEL C, PACCANARO A, GUIDERDONI E, SCHAFFRATH U, MOREL J B, PIFFANELLI P, FAIVRE-RAMPANT O., a monocot WRKY gene, plays a role in the resistance response to blast. Molecular Plant Pathology, 2012, 13(8): 828-841.

[41] HSU F C, CHOU M Y, CHOU S J, LI Y R, PENG H P, SHIH M C. Submergence confers immunity mediated by the WRKY22 transcription factor in. The Plant Cell, 2013, 25(7): 2699-2713.

[42] HUSSAIN A, LI X, WENG Y H, LIU Z Q, ASHRAF M F, NOMAN A, YANG S, IFNAN M, QIU S S, YANG Y J, GUAN D Y, HE S L. CaWRKY22 acts as a positive regulator in pepper response toby constituting networks with CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40, and CaWRKY58. International Journal of Molecular Science, 2018, 19(5): 1426.

[43] ELLINGER D, VOIGT C A. Callose biosynthesis inwith a focus on pathogen response: what we have learned within the last decade. Annals of Botany, 2014, 114(6): 1349-1358.

Effects of Calcium on Growth and Development ofand resistance to Citrus Canker

Xiao GuiHua1,2,3, WEN Kang1,2,3, HAN Jian4, HAO ChenXing1,2,3, YE RongChun1,2,3, ZHU YiChi1,2,3, XIAO ShunYuan1, DENG ZiNiu1,2,3, MA XianFeng1,2,3

1College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;2Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding, Ministry of Education, Changsha 410128;3National Center for Citrus Improvement (Changsha), Changsha 410128;4Hunan Institute of Horticulture, Changsha 410125

【Background】Citrus canker is a bacterial disease caused bysubsp.(), which can infect branches, leaves and fruits, and affects almost all major citrus varieties. The results of a previous survey of 39 citrus orchards in Hunan Province showed that soil acidification and exchange calcium deficiency in citrus orchards were serious and calcium deficiency existed in all leaves. Calcium is one of the elements required by plants in large quantities, and calcium deficiency causes nutritional imbalance, reduced growth potential and compromised plant immunity level. However, the effect of calcium element on the process of citrus infection with canker is not clear.【Objective】The objective of this study is to analyze the pathogenic differences after inoculation within(sensitive to citrus canker) leaves under different calcium concentrations, and to explore the role of calcium ininfection ofleaves.【Method】The seedlings ofwere sand cultured with calcium concentrations of 0, 0.75, 3, and 30 mmol·L-1. During the growth period of, the biomass, chlorophyll a and b concentrations, and calcium content in roots and leaves were determined, as well as the formation of reactive oxygen species (ROS) in roots and callose deposition. The effects ofinoculation on cell wall synthesis-related genes and immune-related genes inleaves were investigated.【Result】Compared with 3 mmol·L-1calcium treatment, 0, 0.75 and 30 mmol·L-1calcium treatments inhibited the growth and development of aboveground and underground parts of, and chlorophyll a and b concentrations decreased. The calcium content in roots and leaves was proportional to the amount of exogenous calcium. ROS and callose deposition were generated in roots after treatment with different calcium concentrations, reaching the maximum at 3 mmol·L-1. after inoculation with, the leaf symptoms gradually decreased with the increase of calcium concentration, but the growth ofhad no significant difference. Compared with 3 mmol·L-1treatment,, a gene involved in cell wall synthesis, was up-regulated and then down-regulated byunder 0 mmol·L-1treatment, and up-regulated byunder 30 mmol·L-1treatment.andwere down-regulated byunder 0 mmol·L-1treatment, and up-regulated byunder 30 mmol·L-1treatment. The expression levels of immune pathway related genes,andinduced byat 30 mmol·L-1were higher than those at 0 and 3 mmol·L-1after inoculation withat 0, 2, 4 and 6 dpi.【Conclusion】The growth and development ofis affected by calcium deficiency and excess, resulting in leaf chlorosis, and ROS production and callose deposition in roots decreased. The sensitive symptoms on the leaf surface caused bywere greatly attenuated after calcium application, but the bacterial content was not significantly different from that of the control. Calcium may promote cell wall thickening by regulating genes related to cell wall synthesis, thereby inhibitingfrom breaking through leaf epidermis and forming typical symptoms.

citrus canker;subsp.(); calcium;; immunity

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.19.007

2022-04-11；

2022-05-17

國家重點研發計劃（2018YFD1000300）、湖湘高層次人才聚集工程（2019RS1052）

肖桂華，E-mail：17843096258@163.com。通信作者馬先鋒，E-mail：ma8006@hunau.edu.cn

（責任編輯 岳梅）