一測多評法同時測定木瓜中5種五環三萜類成分的含量Δ

張亭亭，胡浩寧，李平媛，黃永梅，汪鋆植#，唐海明，尹永紅（1.三峽大學健康醫學院，湖北 宜昌4400；.三峽大學生物與制藥學院，湖北 宜昌 4400；.湖北恒安芙林藥業股份有限公司，湖北宜昌4410）

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai 的干燥近成熟果實，又名皺皮木瓜、鐵腳梨，具有舒筋活絡、和胃化濕之功效，可用于治療濕痹拘攣、腰膝關節酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉筋攣痛、腳氣水腫，有“杏一益，梨二益，木瓜百益”之說[1]。木瓜主要含有黃酮類、有機酸類、三萜類、皂苷類、糖類、鞣質等成分，其中五環三萜類成分為其活性成分，包括齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、3-O-乙酰熊果酸等成分，具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗病毒、抑菌、保護胃黏膜和降血脂等作用[2-3]。木瓜現收載于2020 年版《中國藥典》（一部），僅以齊墩果酸和熊果酸為指標成分進行質量控制[4]。

一測多評（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）法是一種利用中藥有效成分的內在函數及比例關系來實現多指標質量控制的含量測定方法[5]，已被廣泛用于中藥材及其復方制劑的質量控制領域[6-7]。雖然已有學者采用QAMS 法，以齊墩果酸為內參物，但僅同時測定了木瓜中齊墩果酸、熊果酸的含量[8]。由于木瓜中五環三萜類成分復雜，僅對少數幾個成分進行檢測，無法充分反映藥材的整體質量，且其中一些五環三萜類成分的對照品難以獲得、價格昂貴，因此本研究擬采用QAMS 法同時測定木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸5種五環三萜類成分的含量，旨在為木瓜藥材的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、GZX-9240MBE 型鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）、FA2004 型十萬分之一分析天平（上海越平科學儀器有限公司）、KQ-400DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸對照品（批號B20954）、熊果酸對照品（批號B21403）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均不低于98%；白樺脂酸對照品（批號Wkq18030810）、3-O-乙酰熊果酸對照品（批號Wkq17112306）均購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均不低于98%；3-O-乙酰坡模醇酸對照品由三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室制備，經HPLC面積歸一化法檢測其純度≥98%；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

木瓜藥材采自湖北長陽、浙江淳安、安徽宣城、重慶黔江4個產地，經三峽大學生物與制藥學院陳發菊教授鑒定為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠C.speciosa（Sweet）Nakai 的干燥近成熟果實。將同一產地樣品分為兩部分，一部分用鮮切工藝進行炮制（將木瓜對半縱剖，然后切薄片，于80 ℃烘干）；另一部分用傳統工藝進行炮制（將木瓜對半縱剖，曬干，經潤透或蒸透后切薄片，于80 ℃烘干），共得到8 批木瓜樣品，其具體來源信息見表1。

表1 木瓜藥材樣品的來源信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以COSMOSIL 5 C18-MS-Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.005 mol/L 磷酸氫二銨溶液（用磷酸調pH 至6.5）（70∶30，V/V）為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm；進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別取3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸對照品約8、4、19、16、8 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得混合對照品貯備液；精密量取該貯備液1 mL，加甲醇適量，制得上述各成分質量濃度分別為81.2、42.4、192.3、155.4、84.1 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 系統適用性試驗

取上述混合對照品溶液、供試品溶液（編號S1）、空白對照溶液（甲醇），按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1（空白對照溶液圖略）。由圖1可知，3-O-乙酰坡模醇酸等5 種成分的分離效果較好，分離度均大于1.5，空白對照溶液對測定無干擾。

圖1 3-O-乙酰坡模醇酸等成分混合對照品溶液、供試品溶液的HPLC圖

2.4 線性關系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，分別用甲醇稀釋1、5、10、15、20倍，得系列線性溶液。取上述各線性溶液及混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，具體結果見表2。

表2 3-O-乙酰坡模醇酸等成分的回歸方程和線性范圍

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸峰面積的RSD 分別為2.65%、2.90%、1.00%、1.85%、0.49%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸峰面積的RSD分別為0.35%、2.71%、1.66%、0.90%、1.09%（n＝8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

精密稱取木瓜藥材樣品（編號S1）粉末1.0 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的RSD 分別為1.97%、2.86%、2.19%、0.94%、2.14%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的木瓜藥材樣品（編號S1）粉末50 mg，共6 份，分別加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均加樣回收率分別為100.47%、100.16%、98.29%、101.38%、98.40%，RSD 分別為0.90%、2.07%、0.41%、1.67%、1.56%（n＝6）。

2.9 QAMS法相對校正因子的確定

2.9.1 相對校正因子的計算 取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣1、2、5、10、20 μL，以齊墩果酸（含量較高且對照品易得）為內參物，按下式計算齊墩果酸相對于其他成分的相對校正因子（fsi）：fsi＝（As/Cs）/（Ai/Ci）（式中，As為內參物峰面積，Cs為內參物質量濃度，Ai為待測成分色譜峰峰面積，Ci為待測成分質量濃度[5]）。結果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均相對校正因子分別為1.281、1.641、1.261、1.408，RSD 分 別 為2.090%、2.280%、1.250%、1.040%（n＝5），表明各成分相對校正因子的準確性較好。

2.9.2 耐用性考察 取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，考察不同色譜儀（DIONEX Ultimate 3000 型HPLC 儀、島津LC-20A 型HPLC儀）、色譜柱[Ultimate XB Cl8、Cosmosil C18-MS-Ⅱ、SPOLAR C18（規格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）]對相對校正因子的影響。結果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的平均相對校正因子分別1.286、1.630、1.252、1.413，RSD 均小于3%（n＝5）,表明不同色譜儀及色譜柱對3-O-乙酰坡模醇酸等4種成分的相對校正因子無明顯影響，該方法耐用性良好。

2.9.3 相對校正因子的確定 根據“2.9.2”項下結果，最終確定3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸的相對校正因子分別為1.286、1.630、1.252、1.413。

2.9.4 色譜峰的定位 取“2.2.1”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別考察不同色譜儀（DIONEX Ultimate 3000 型HPLC 儀、島津LC-20A 型HPLC儀）、色譜柱[Ultimate XB Cl8、Cosmosil C18-MS-Ⅱ、SPOLAR C18（規格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）]對相對保留時間的影響。結果顯示，3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸相對保留時間的RSD 均小于5%（n＝5），表明相對保留時間法可用于3-O-乙酰坡模醇酸等成分的初步定位。

2.10 樣品含量測定

取8 批木瓜藥材樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，分別按外標法、QAMS法（以齊墩果酸為內參物）計算樣品含量，采用相對偏差[相對偏差＝（QAMS法含量-外標法含量）/外標法含量×100%]考察2 種方法所得結果的差異。每樣品平行測定3次，結果見表3。

表3 木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸等成分的含量測定結果（n＝3，%）

由表3 可知，2 種方法所得含量測定結果的相對偏差均小于8%。同時，采用SPSS 22.0 軟件對2 種方法所得含量結果進行t檢驗，結果顯示，2 種方法所得結果組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），表明采用QAMS法同時測定木瓜中多種三萜類成分是可行的。

此外，本研究采用外標法比較了不同產地鮮切和傳統工藝加工木瓜中齊墩果酸與熊果酸的總含量及5種成分的總含量，結果見表4。

表4 不同產地鮮切和傳統工藝加工木瓜中部分成分的含量比較（±s，n＝3，%）

表4 不同產地鮮切和傳統工藝加工木瓜中部分成分的含量比較（±s，n＝3，%）

a：與重慶黔江產木瓜比較，P＜0.05

產地湖北長陽浙江淳安安徽宣城重慶黔江齊墩果酸與熊果酸的總含量鮮切工藝0.680 5±0.013 9 0.583 5±0.006 6 0.639 5±0.005 9 0.528 0±0.008 3傳統工藝0.636 5±0.012 4 0.537 5±0.015 9 0.609 5±0.005 9 0.518 5±0.005 9 5種成分的總含量鮮切工藝0.916 0±0.006 3a 1.061 0±0.047 9a 0.818 0±0.006 8a 1.306 5±0.035 5傳統工藝0.829 0±0.007 5a 0.817 5±0.026 5a 0.770 5±0.021 0a 1.283 5±0.041 7

由表4 可知，不同木瓜樣品中齊墩果酸與熊果酸的總含量均不低于0.5%，符合2020 年版《中國藥典》（一部）的要求[4]。不同產地、不同炮制工藝木瓜樣品中5種成分的總含量存在差異；而在同一產地的鮮切工藝加工木瓜中，2 種成分的總含量和5 種成分的總含量均高于傳統工藝加工木瓜，平均升高5.62%、10.83%，其中重慶黔江產木瓜中5 種成分的總含量顯著高于其他產地（P＜0.05）。

3 討論

木瓜中的五環三萜類成分是其主要的活性成分[9-10]。本課題組前期比對了相關文獻[11-12]，并在HPLC分析的基礎上，最終選擇了3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸作為木瓜藥材質量評價的指標。

本課題組前期曾采用2020 年版《中國藥典》（一部）“木瓜”項下齊墩果酸和熊果酸的色譜條件進行測定，但實踐結果顯示，各成分的分離度欠佳；隨后，參照相關文獻[13-14]，對色譜條件進行優化，最終確定了“2.1”項下色譜條件。系統適用性試驗結果顯示，各成分分離良好，此法可用于木瓜中多種五環三萜類成分的定量分析。

含量測定結果顯示，QAMS法與外標法所得3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的相對偏差均小于8%，表明2種方法所得含量結果無明顯差異。不同產地鮮切和傳統工藝加工木瓜中齊墩果酸與熊果酸的總含量均不低于0.5%，5種成分的總含量均不低于0.7%；在同一產地的鮮切工藝加工木瓜中，無論是齊墩果酸與熊果酸的總含量還是5種成分的總含量均高于傳統工藝加工木瓜，其中齊墩果酸和熊果酸的總含量平均升高5.62%，5種成分的總含量平均升高10.83%。這表明不同產地、不同炮制工藝木瓜中5種成分含量存在差異，以多成分為指標進行質量分析較單一指標更為科學、合理。此外，木瓜鮮切片采用產地加工炮制一體化工藝，集中采收鮮果，一次性加工，中間環節明顯減少且操作規范，有利于提高木瓜藥材的質量。

綜上所述，本研究建立了同時測定木瓜中3-O-乙酰坡模醇酸、白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸、3-O-乙酰熊果酸含量的QAMS法，該方法簡便、快速、準確。重慶黔江產木瓜中5種成分的總含量較高，且同一產地鮮切工藝加工木瓜總含量高于傳統工藝加工木瓜。