安吉白茶揮發性成分及關鍵呈香成分分析

石亞麗，白 艷，馬婉君，朱 蔭，王佳童，邵晨陽，嚴 寒，林 智,，呂海鵬,

（1.農業農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081；3.安吉縣農業農村局，浙江 湖州 313300）

白化茶樹是一類在特定環境下新梢呈現白化表型的茶樹突變體，是我國重要的茶樹種質資源之一。根據白化誘因，分為生態敏感型（低溫敏感型和光照敏感性）、生態不敏感型、生態復合型等。根據GB/T 20354—2006《地理標志產品 安吉白茶》，安吉白茶產自浙江省安吉縣現轄行政區內，以浙江省優良無性系良種“白葉一號”為原料，采用烘青綠茶的制作工藝（攤青、殺青、理條、初烘、焙干）加工而成。白葉一號屬于“低溫敏感型”的白化茶樹品種，溫度閾值為17～25 ℃，一般在每年的4月份鮮葉產生白化，出現“葉白脈綠”的現象，即葉片玉白色，葉脈翠綠色。安吉白茶是綠茶中的名優茶產品，其優異的香氣品質是消費者青睞的重要因素之一，具有“嫩香持久”、“清香”等特點，且品質越好，香氣持久度越好；此外，白化茶中氨基酸含量較高，茶葉加工過程中易與兒茶素等反應形成揮發性醛類等，正是安吉白茶特殊的物質組成造成了其獨特的香氣品質。

香氣作為評價茶葉品質的一個重要指標，實質上是不同濃度和種類的揮發性成分組合的綜合效果。受化合物氣味閾值及呈香特性的影響，單個化合物對于茶葉整體香型的貢獻度不同，從眾多揮發性成分中鑒定出具有關鍵貢獻作用的化合物至關重要。目前為止，已在茶葉中鑒定出700多種揮發性化合物，但只有少部分活性化合物影響著茶葉的整體香氣特征，這些化合物對茶葉特殊香型的構成必不可少，被稱為關鍵呈香成分。近年來，安吉白茶的研究主要集中在非揮發性成分方面，而揮發性成分僅有少量的報道，目前關于其揮發性成分組成及關鍵呈香成分仍缺乏系統研究；此外，指紋圖譜是目前國際上公認的食品質量控制的有效手段之一，已在葡萄酒、亞麻籽油等食品中得到廣泛的應用，但目前尚無安吉白茶指紋圖譜的相關報道。

因此，本研究擬采用攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術分析20 個安吉白茶樣品的揮發性成分組成，采用氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatography-olfactometrymass spectrometry，GC-O-MS）技術與相對氣味活性值（relative odour active value，ROAV）方法鑒定安吉白茶的關鍵呈香成分，并嘗試構建安吉白茶揮發性成分指紋圖譜。本研究旨在解析安吉白茶的揮發性成分及關鍵呈香成分，揭示安吉白茶的香氣品質的重要化學物質基礎，為安吉白茶香氣品質調控與質量控制等提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安吉白茶樣品共20 個，其中精品（AJBC1-5）、特級（AJBC6-10）、一級（AJBC11-15）、二級（AJBC16-20）各5 個（表1）。茶樣（精品）等比例混合為標準混合茶粉作為后續的GC-O分析樣品。

表1 安吉白茶樣品詳細信息Table 1 Detailed information of Anjibaicha samples collected in this study

無水氯化鈉 上海Sigma-Aldrich公司；正構烷烴（C～C）、癸酸乙酯 北京百靈威科技有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

PDMS攪拌棒（長度10 mm，厚度0.5 mm，含量24 μL）、ODP2 GC-O分析嗅聞口 德國Gerstel公司；SP200-2 T多磁力位點攪拌器 杭州米歐儀器有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀、HP-5ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 SBSE萃取

參照本實驗室已建立的方法。具體步驟如下：準確稱取600 mg茶粉與500 mg氯化鈉加入20 mL頂空瓶中，加入10 mL沸水平衡1 min后，加入PDMS攪拌子，在磁力攪拌器上以1 200 r/min的轉速攪拌萃取30 min后取出攪拌子，并用純凈水洗凈攪拌子表面殘留茶粉，無紡布擦干后暫存放于1.5 mL小瓶中待測。

1.3.2 熱脫附、冷進樣系統

熱脫附系統：初始溫度30 ℃，保持1 min；以100 ℃/min升溫至240 ℃，并保持5 min。

冷進樣系統：以液氮（99.99%）在-100 ℃下保持1 min后，以12 ℃/s升溫速率至280 ℃，保持3 min。

1.3.3 GC-MS檢測

色譜參數：初始溫度50 ℃，保持2 min，然后以4 ℃/min的速率升溫至170 ℃，保持5 min后，以10 ℃/min升溫至265 ℃，保持5 min。溶劑排空模式，以高純度氦（＞99.9%）為載體，流速1.6 mL/min。

質譜參數：電子電離源；溫度220 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍30～600 u。

定性分析：通過NIST 2014數據庫對GC-MS檢測的化合物定性，依據正構烷烴測得各化合物的保留指數實驗值，與數據庫中理論值對比，要求兩者差值在20以內。

定量分析：以癸酸乙酯作標準曲線計算各化合物含量。

1.3.4 GC-O-MS測定

升溫程序同1.3.3節，嗅聞口與質譜系統1∶1分流進樣，嗅聞口載氣為高純氮氣，嗅聞系統進樣口和傳輸線的溫度分別設定為230 ℃和260 ℃。

6 位嗅聞小組成員均具備嗅聞經驗，嗅聞強度以1～4表示，1表示強度最弱，依次增強，4為最強，至少3 位小組成員在同一時間階段嗅聞到相似的氣味感官描述。

1.3.5 ROAV分析

根據各化合物在水中的氣味閾值，按下式計算化合物的ROAV：

式中：C為化合物相對于癸酸乙酯計算得到的含量/（μg/kg）；OT為化合物在水中的氣味閾值/（μg/kg）。

1.4 數據處理

利用Origin 2018繪制柱狀圖與指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 安吉白茶揮發性成分分析

采用GC-MS對20 個安吉白茶樣品的揮發性成分進行檢測，通過譜庫檢索、保留指數、特征離子對比，在安吉白茶中共鑒定109 種揮發性成分，按照其化學結構性質可分為11 類，包括醇類16 種、醛類13 種、酮類18 種、酯類29 種、內酯3 種、烯烴類6 種、酸類8 種、芳香族7 種、含氧雜環4 種、含氮雜環3 種、酰胺類2 種。其中含量較高的類別為醇類（3 748.33 μg/kg）、酯類（2 255.93 μg/kg）、酸類（874.81 μg/kg）、酮類（793.43 μg/kg）、醛類（566.82 μg/kg），而含氮雜環（325.88 μg/kg）、內酯（254.47 μg/kg）、含氧雜環（233.81 μg/kg）、芳香族化合物（224.82 μg/kg）、烯烴類（216.40 μg/kg）、酰胺類（57.67 μg/kg）含量相對較低（表2）。由此可見，醇類、酯類、酸類、酮類、醛類是安吉白茶中主要的揮發性成分。其中，酸類化合物在安吉白茶中含量相對較高，而不含一些特殊的含硫化合物可能是其區別于常規綠茶（例如龍井茶）的重要特點之一。

醇類中含量較高的化合物為香葉醇（2 502.80 μg/kg）、植醇（458.09 μg/kg）、芳樟醇（252.73 μg/kg）。研究表明，白葉一號新梢白化與返綠時期的差異表達基因主要參與代謝途徑、次級代謝物生成等。這可能是安吉白茶特異性香氣形成的前提條件。香葉醇可能是區分白化階段與返綠階段的關鍵差異化合物。芳樟醇具有-(+)-芳樟醇和-(-)-芳樟醇2 種香氣品質差異較大的光學異構體，在綠茶中主要以-(+)-芳樟醇形式存在。香葉醇與芳樟醇具有相同的合成前體——香葉基焦磷酸酯。同時生物脅迫途徑也可以促進此類化合物的釋放，例如茶卷葉蛾侵害茶樹后可促使茶葉釋放芳樟醇，而茶蚜蟲可促進香葉醇、芳樟醇的釋放。

酯類是數量最多的一類化合物，含量僅次于醇類。其中，鄰苯二甲酸二異丁酯（635.66 μg/kg）、水楊酸甲酯（291.07 μg/kg）、()-己酸-3-己烯酯（246.98 μg/kg）等含量較高。但以往研究發現白化誘導的偏黃色葉片中水楊酸甲酯的含量顯著低于一般綠色葉片。其他含量較高的化合物有亞麻酸、十八酸、香葉酸、順式茉莉酮、反式--紫羅蘭酮、己醛、庚醛、茉莉酸內酯、吲哚。其中，亞麻酸是不飽和脂肪酸的氧化產物，脂肪酸氧化是產生有機酸類化合物的重要途徑之一。反式--紫羅蘭酮是類胡蘿卜素降解的相關產物，在紅茶香氣與滋味的協同研究中發現，外源添加反式--紫羅蘭酮可以增強茶湯的甜味，說明它對于茶葉風味品質的形成具有重要的作用。另外，己醛、庚醛也屬于脂類氧化產物，由于兒茶素對羰基類化合物具有較強的清除能力，己醛等羰基化合物的含量在綠茶貯藏過程中易降低，而安吉白茶中己醛、庚醛含量較高很可能是由于其富含的氨基酸反應產生。

另外，按照鮮葉原料的質量要求，一般將安吉白茶成品茶分為4 個品質等級：精品、特級、一級、二級。理解不同等級揮發性成分的組成差異，有助于為安吉白茶的等級劃分和加工品質調控等提供依據。有研究發現，白化茶揮發性成分總量顯著低于普通綠色芽葉。比較4 個等級樣品中揮發性成分總量發現，二級的樣品揮發性成分含量高于其他等級（圖1）。這可能是因為在茶樹的生長過程中，隨葉片成熟度增加，芽葉白化程度略有降低，即二級茶葉的白化程度可能略低于其他等級，使得其揮發性成分總量略高。由表2可知，醇類、酸類化合物的含量隨樣品等級降低而先增加后減少，含氮雜環類與之相反，而醛類化合物隨等級降低逐級增加。醛類化合物是茶葉清香品質的主要來源，其含量的增加或與高等級安吉白茶的嫩香品質向較低等級安吉白茶樣品的清香品質轉變有關。由此可見，醛類化合物的含量可能與安吉白茶的品質等級變化密切相關；此外，二級樣品中香葉醇的含量（1 725.14 μg/kg）明顯低于其他等級（2 919.04、2 946.80、2 420.22 μg/kg），表明香葉醇含量可能與安吉白茶品質等級有一定的相關性。

表2 安吉白茶揮發性成分及含量Table 2 Contents of volatile compounds in Anjibaicha

續表2

續表2

圖1 不同等級安吉白茶揮發性成分組成Fig.1 Composition of volatile components in different grades of Anjibaicha

2.2 安吉白茶香氣指紋圖譜的構建

綜合比較安吉白茶GC-MS總離子流圖各特征峰峰面積、保留時間，從全部的揮發性成分中篩選出34 個共有峰作為指紋圖譜的特征峰，建立安吉白茶揮發性成分指紋圖譜（圖2）。由表3可知，34 種化合物主要為酯類、醇類、醛類、酸類化合物。以豐度最高的香葉醇作為參考峰，將其保留時間與峰面積設為1，以此為基礎計算另外33 個化合物的相對保留時間及相對峰面積。結果表明，所有安吉白茶樣品中全部共有特征峰的平均相對保留時間介于0.322 6～1.998 8之間，平均相對峰面積介于0.012 0～0.307 5之間。其中，鄰苯二甲酸二異丁酯、植醇、吲哚、順式茉莉酮、亞麻酸、()-己酸-3-己烯酯、水楊酸甲酯、十八酸、芳樟醇等是安吉白茶中共有的相對峰面積較高的特征峰。

圖2 安吉白茶揮發性成分指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of volatile components in Anjibaicha

表3 安吉白茶的香氣數字化特征指紋圖譜Table 3 Digital characteristic fingerprint of aroma components in Anjibaicha

為驗證模式圖譜對各樣品的代表性，計算已篩選的特征化合物峰面積占總峰面積的比例，以夾角余弦為標準計算各樣本與模式圖譜的相似度與相關系數。由表4可知，各樣品中共有特征峰的峰面積均大于其總峰面積的75%，且20 個安吉白茶樣品中，除AJBC-19、AJBC-20外，其他樣品與模式圖譜的相似度較高，均大于0.9，且相關系數也均大于0.9。表明該模式圖譜基本符合指紋圖譜的要求。安吉白茶指紋圖譜的構建，有助于為今后安吉白茶產品的香氣品質評價、真假甄別以及加工工藝提升等提供重要參考。

表4 安吉白茶指紋圖譜的相似度計算Table 4 Fingerprint similarity calculated for Anjibaicha

2.3 安吉白茶關鍵呈香成分的鑒定

2.3.1 安吉白茶關鍵呈香成分的GC-O分析

由表5可知，經GC-O分析，共有34 種化合物被鑒定為安吉白茶的關鍵呈香成分。按照化合物的結構性質將其分為醇類（8 個）、醛類（7 個）、酯類（6 個）、酮類（4 個）、含氮雜環（4 個）、內酯類（2 個）、酸類（2 個）、芳香族化合物（1 個）。其中，香氣強度值不小于3的化合物有()-己酸-3-己烯酯（3.20）、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）（3.17）、壬醛（3.00）、吲哚（3.00）、鄰氨基苯甲酸甲酯（3.00）、-紫羅蘭酮（3.00）、反式--紫羅蘭酮（3.00）。()-己酸-3-己烯酯（3.20）香氣強度值最高，是綠茶中常見的香氣化合物，帶有果甜香，對黃山毛峰、西湖龍井茶香氣形成具有重要的貢獻。芳樟醇氧化物在茶葉中有4 種存在形式，可能是加工過程中由芳樟醇氧化產生，或者由其自身相關的糖苷降解產生。壬醛帶有清新的、類似于黃瓜的氣味，由不飽和脂肪酸——油酸、棕櫚油酸氧化生成，是“清香”綠茶重要的香氣化合物。吲哚隨濃度變化呈現出不同的香型，高濃度時帶有不愉快的氣味，低濃度則具有明顯的花香，它可能由色氨酸經色氨酸裂解酶氧化裂解產生，也可能是由左旋色氨酸在熱解條件下轉化生成。另外，-紫羅蘭酮、反式--紫羅蘭酮是茶葉中普遍存在的香氣化合物，均屬于類胡羅卜素衍生物，其中，反式--紫羅蘭酮具有極低的香氣閾值，或對于安吉白茶香氣品質的形成具有重要的作用。

2.3.2 安吉白茶關鍵呈香成分的ROAV計算

ROAV一般用于評價單個化合物對于整體香氣的貢獻度，一般認為ROAV不小于1的化合物對于香氣形成具有重要的作用，即被認定為關鍵呈香成分。因此，在GC-O鑒定的基礎上，進一步計算34 種化合物的ROAV。由表5可知，共有16 種化合物ROAV不小于1。其中，ROAV較大的化合物為反式--紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇、己醛、庚醛、()-2-庚烯醛、-紫羅蘭酮、()-己酸-3-己烯酯。反式--紫羅蘭酮（紫羅蘭香、奶香）不僅具有較高的香氣強度值，還具有最高的ROAV。20 個樣品的香氣感官審評結果中，安吉白茶樣品除基礎的嫩香、清香屬性外，部分樣品還呈現出較明顯的甜香，少數樣品具有微弱的花香，且僅在二級樣品中發現了花香特性。因此，可以推測反式--紫羅蘭酮除可增加茶湯的甜味之外，可能還有助于形成安吉白茶的甜、花香品質。此外，在不同等級安吉白茶樣品中，可能由于香氣化合物之間復雜的互作效應，其呈香特性也具有一定的偏好性。由此可見，它是構成安吉白茶香氣品質的重要化合物。此外，同一香氣化合物在不同濃度下呈香特性可能有所不同。例如，1-辛烯-3-醇、己醛等在本研究中被嗅聞到帶有青草氣，可能是市場上一些安吉白茶產品稍帶青氣的原因，這與生產工藝密切相關；而己醛曾被鑒定為清香型鐵觀音清香味的主要來源，這類化合物也可能參與形成安吉白茶的清香、甜香品質。結果表明，反式--紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇、-紫羅蘭酮等化合物由于其較低的氣味閾值是多種茶葉的關鍵呈香成分。而GC-O與ROAV在鑒定結果上存在差異可能是因為兩者基于的前體條件不同，GC-O以空氣為介質，而ROAV的計算往往基于該化合物在水中的閾值。

茶葉中香氣化合物組成復雜且結構各異，香型的形成不是各成分之間的簡單加和，而是基于復雜的相互作用形成的。研究表明，結構或香氣相似的化合物之間易發生協成或加成作用，而結構或香氣性質差異大的成分之間易發生掩蓋作用。由表5可知，安吉白茶關鍵呈香成分的氣味類型可以分為果香、甜香、清香、花香、青氣。其中，果香、甜香與花香或清香與青氣這2 種類型的關鍵呈香成分之間是否存在協同效應，或甜香、青香之間是否存在掩蓋作用還需要進一步研究。

表5 GC-O與ROAV鑒定的關鍵呈香成分Table 5 Key aroma-active compounds identified by GC-O and ROAV

3 結論

采用SBSE-GC-MS技術解析20 個代表性安吉白茶樣品的揮發性成分，并建立安吉白茶的揮發性成分指紋圖譜。研究表明，在安吉白茶中鑒定11 類共計109 種揮發性成分，其化學組成以醇類、酯類、酸類、酮類、醛類等成分為主；其中，香葉醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、植醇、吲哚、順式茉莉酮、亞麻酸、()-己酸-3-己烯酯、水楊酸甲酯、十八酸、芳樟醇等是含量較高的揮發性成分；基于此建立的安吉白茶指紋圖譜在大多樣品中相似度與相關系數均大于0.9，表明該模式圖譜是可靠的。

此外，安吉白茶的關鍵呈香成分以醇類、醛類、酯類為主，GC-O與ROAV兩種方法同時確定了安吉白茶中的16 種香氣化合物，包括反式--紫羅蘭酮、香葉醇、芳樟醇、己醛、庚醛、()-2-庚烯醛等，表明這些化合物對安吉白茶嫩香、清香或甜香品質可能具有重要貢獻。本研究結果豐富了安吉白茶香氣品質化學的基礎理論，有助于為安吉白茶香氣品質的科學評價、質量等級判別以及加工品質調控等提供依據。