金針菇多糖對大豆分離蛋白凝膠的增強作用及其結構表征

潘泓杉，馬高興，裴 斐，馬 寧，仲 磊，趙立艷，胡秋輝,

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023；2.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）作為目前商業化程度較高的植物蛋白，具有成本低廉、易于獲取、氨基酸平衡且營養價值高等優點。凝膠性是大豆蛋白的重要性質，由于其水凝膠具有高營養、高生物相容性等優點，在食品領域具有營養補充、包埋遞送風味和活性物質等多種應用。但純大豆蛋白水凝膠具有力學性能不足、溶解性差等多種問題，限制了大豆蛋白水凝膠在食品領域的應用。

熱處理及化學改性是改善大豆蛋白水凝膠性質的較為溫和、方便的方式。利用大豆蛋白的熱變性能使聚合物中分子鏈通過氫鍵、范德華力等交聯構成復雜的網絡結構，以形成更均勻、致密的凝膠網絡，從而獲得更穩定不易破碎的凝膠結構。有報道表明添加多糖類大分子與大豆蛋白結合也可以改善大豆蛋白水凝膠性質；劉冉等通過加入黃原膠（xanthan gum，XG）促進大豆蛋白凝膠化形成半互穿網絡凝膠，提高了大豆蛋白凝膠的熱穩定性。Dekkers等通過高溫及高剪切力作用改善了果糖-大豆蛋白微觀結構和拉伸強度。金針菇多糖（polysaccharides，FVP）作為食用菌中提取的天然多糖，不僅具有益智、免疫活性、抗腫瘤活性等高生物活性，且作為多羥基結構的非凝膠性陰離子多糖具有改善大豆蛋白水凝膠的潛力。

本研究將FVP與SPI混合并進行加熱處理，通過分析水凝膠的結構變化以闡明水凝膠形成過程及凝膠強度變化的機理，旨在為大豆蛋白水凝膠高營養、寬領域的應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇粉 陜西金碩果業有限公司。SPI（蛋白質質量分數≥85%）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白濃度測定試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度99%）、乙二胺四乙酸二鈉（NaEDTA，純度99%）、甘氨酸（Gly，純度99%）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，純度95%） 北京索萊寶科技有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS，純度98%） 上海源葉生物科技有限公司；2-硝基苯甲酸（DNTB，純度95%）、-巰基乙醇（純度98%） 上海麥克林生化科技有限公司；其余所用試劑均為化學分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MCR302 流變儀奧地利 Anton Paar 公司；FreeZone真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 江蘇常州國華電器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；J-1500圓二色光譜儀 日本分光株式會社；F-7000熒光分光光度計 日本日立高新株式會社；SpectraMax-190酶標儀 美國Molecular Devices公司；8000差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC） 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 FVP的提取

參照Yang Wenjian等的方法并稍作修改。將金針菇粉和水以1∶25（g/mL）混合，置于80 ℃水浴浸提5 h，10 752×離心10 min，取上清液。加入Sevag試劑（正丁醇∶三氯甲烷＝1∶4，/）靜置10 min，17 808×離心15 min，取上清液。除蛋白操作重復3 次以上。向上清液中加入其4 倍體積的95%乙醇溶液沉淀過夜，濾出的絮狀物用透析袋（截留分子質量3.5 kDa）透析至溶液均一狀態，-20 ℃預凍后真空干燥得到FVP粗提物。使用Solarbio總糖檢測試劑盒測得FVP粗提物中多糖含量為（66.52±1.59）%。

1.3.2 FVP-SPI水凝膠制備

前期預實驗發現，添加5% FVP制備的FVP-SPI（以加入的干粉質量計）水凝膠穩定性最高（其余實驗組FVP添加量為0%、2.5%、5%、7.5%）。因此，后續實驗中FVP的添加量為5%，對照組XG的添加量也為5%。

將超純水或5%的FVP或XG加入超純水中以400 r/min磁力攪拌至完全溶解，加入SPI充分攪拌至順滑無顆粒狀，即為SPI、FVP-SPI和XG-SPI冷水凝膠。將冷水凝膠于90 ℃水浴加熱30 min，得到熱處理水凝膠（h-SPI、h-FVP-SPI、h-XG-SPI）。

1.3.3 動態流變學特性的測定

參照Sharma等的方法并稍作改動，使用MCR 302流變儀對各冷、熱凝膠進行測定，用PP-50夾具以1 mm的間隙進行實驗。使用刮板清除多余樣品并使用硅油液封，防止水分揮發。冷水凝膠在1 Hz、1%應力條件下從25 ℃加熱至90 ℃，90 ℃維持30 min，再從90 ℃降至25 ℃，最后在25 ℃、應力1%、0.1～10 Hz頻率范圍下掃描，以評估熱處理過程中水凝膠結構變化過程。

1.3.4 持水性的測定

分別精確稱取2 g各水凝膠（）于離心管中，10 000×離心15 min，稱取離心后各水凝膠失去的水的質量（），計算水凝膠持水率：

1.3.5 熱穩定性的測定

將冷凍干燥的水凝膠粉碎，分別精確稱量2.0 mg各凍干水凝膠粉末于PerkinElmer高壓盤中，使用DSC儀測定。溫度變化范圍20～150 ℃；升溫速率10 ℃/min；氮氣流速20 mL/min。

1.3.6 蛋白質二級結構的測定

使用PBS溶液制備SPI質量濃度為0.2 mg/mL的各水凝膠溶液。使用J-1500圓二色光譜儀和石英比色皿。設置氮氣流速為2 L/min，在190～240 nm波長處測定，使用Spectra manager分析圖譜軟件進行二級結構分析。

1.3.7 蛋白質三級結構的測定

使用PBS配制成SPI質量濃度為10 μg/mL的各水凝膠溶液，以PBS作為空白對照，利用熒光分光光度計測定發射波長300～500 nm下的熒光光譜。激發波長280 nm，掃描速率600 nm/min，狹縫寬度5 nm。

1.3.8 溶解度的測定

參照Wang Wenjie等的方法測定水凝膠在不同溶劑下的溶解度，使用的5 種溶劑為：A：蒸餾水；B：Tris甘氨酸緩沖液（pH 8.0，含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly和4 mmol/L NaEDTA）；C：B+2% SDS；D：C+8 mol/L尿素；E：D+1%-巰基乙醇。將1.3.2節中制備的水凝膠完全浸沒于上述5 種溶劑并連續攪拌，以8 000×離心20 min，使用BCA試劑盒測量上清液中的蛋白質含量。計算水凝膠的溶解度：

式中：為上清液中蛋白質質量；為加入水凝膠的總蛋白質質量。

水凝膠在溶劑間溶解度的差異表示分子間相互作用力的大小，其中溶劑B、A間代表靜電相互作用，溶劑C、B間代表疏水相互作用，溶劑D、C間代表氫鍵相互作用，溶劑E、D間代表二硫鍵相互作用。

1.3.9 游離巰基含量的測定

參照Zhang Mingkai等的方法。分別稱取40 mg各凍干水凝膠粉末溶解于pH 8.0的4 mL Tris-Gly緩沖溶液（含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly和4 mmol/L NaEDTA）中，常溫放置30 min后10 000×離心20 min。取上清液，加入30 μL Ellman試劑溶液（4 mg DTNB溶于1 mL Tris-Gly緩沖溶液），25 ℃反應15 min。使用酶標儀在412 nm波長處測定吸光度（），使用BCA試劑盒測定上清液中蛋白質質量濃度（/（mg/mL））。計算游離巰基含量：

式中：＝13 600 L/（mol·cm），為吸光系數；為稀釋倍數。

1.3.10 表面疏水性的測定

參考Zhong Lei等的方法，用PBS制備不同SPI質量濃度（0、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL）的水凝膠溶液。取4 mL水凝膠溶液與20 μL 8 mmol/L ANS混合后避光反應20 min測定熒光強度。激發波長365 nm，發射波長484 nm。計算熒光強度-蛋白質質量濃度的線性回歸斜率，斜率為蛋白質表面疏水性。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 熱處理對FVP-SPI水凝膠形成過程流變學特性的影響

通過測定熱處理過程中水凝膠儲能模量（′）及耗能模量（″）的變化模擬水浴加熱至90 ℃時FVP-SPI水凝膠的形成過程?！湓礁叽硭z彈性越強，″越高代表水凝膠黏性越強。如圖1所示，溫度從25 ℃至90 ℃上升過程中，各水凝膠′和″均呈下降趨勢，此過程是蛋白質受熱變性過程。溫度在穩定90 ℃的過程中，各水凝膠′和″呈先緩慢下降后迅速上升的趨勢，此過程中SPI本身或與多糖相互交聯形成新的網狀結構，使其′和″得到明顯提升，水凝膠結構更為穩定、致密。溫度從90 ℃下降至25 ℃過程中，各水凝膠的′無明顯變化，″有所下降，表明新的水凝膠結構已經形成，溫度降低也無法使水凝膠恢復，所以這種變化并非是可逆的物理變化，而是發生了斷鍵重組的化學變化。

圖1 熱處理過程中水凝膠G′和G″的變化Fig.1 Changes in G′ and G″ of hydrogels during heat treatment

2.2 FVP對SPI水凝膠持水性的影響

如圖2所示，各水凝膠的持水性有一定差異，其中SPI水凝膠的持水性最差。經過熱處理或添加多糖，各水凝膠的持水性顯著提升（持水率均超過95%），但這些水凝膠的持水性無顯著差異（＞0.05）。其中，與SPI水凝膠相比，h-FVP-SPI水凝膠的持水率增加了10.59%。水凝膠的持水性在一定程度上反應了水凝膠的抗干擾能力，在實際應用中，水凝膠在受壓、切割等外界干擾下維持內部水的吸附和結合能力非常重要。通過高速離心可以反映出水凝膠在受壓時的穩定性。這表明添加5% FVP和90 ℃下加熱30 min的處理均能提高水凝膠對水的吸附和結合能力，提高水凝膠的穩定性和抗干擾能力。此外，FVP對SPI水凝膠持水性的提升能力與XG無顯著差異。

圖2 不同水凝膠的持水率Fig.2 Water-holding capacity of different hydrogels

2.3 FVP對SPI水凝膠熱穩定性的影響

如表1所示，各水凝膠的第一個峰出現在55～58 ℃范圍內，這個小吸熱峰顯示蛋白纖維的“自增強”特性。對于SPI水凝膠而言，其DSC曲線中的吸熱峰主要歸因于-伴大豆球蛋白及11S球蛋白的溶解或分離。純SPI水凝膠的和在熱處理前后差異不顯著，而添加多糖后，熱處理前后的水凝膠的發生顯著變化。熱水凝膠樣品的和較冷水凝膠升高。這些結果說明熱處理后，多糖與蛋白發生交聯；添加多糖后，多糖與蛋白質以非共價鍵結合構建了更復雜的網絡結構，使得其需要更高的變性溫度。Δ和Δ也有相似的變化規律，其中，h-FVP-SPI水凝膠較SPI水凝膠總焓變提高了25.46%。在熱處理后，水凝膠的Δ和Δ更高；添加FVP的水凝膠比純SPI水凝膠的Δ和Δ更高，這意味著添加FVP的水凝膠更為穩定。對比XG，FVP的添加提高了SPI水凝膠的熱變性溫度且焓變差異不顯著。

表1 不同水凝膠的熱穩定性Table 1 Thermal stability of different hydrogels

2.4 FVP-SPI凝膠結構的表征分析

2.4.1 FVP對SPI水凝膠二級結構的影響

SPI水凝膠的二級結構通過蛋白質分子在部分區域上通過多肽鏈在一定方向上盤繞折疊維持，包括-螺旋、-折疊、-轉角和無規卷曲，通過分子內蛋白質或蛋白質與連續相之間的氫鍵保持局部空間排列。如表2所示，與SPI水凝膠相比，FVP-SPI水凝膠的-螺旋含量無顯著差異，-折疊含量增加了12.9%；h-FVP-SPI水凝膠的-螺旋含量減少了16.8%，-折疊含量增加了17.2%。在蛋白質或多肽的規則二級結構中，肽鏈是高度有序的，排列的方向性決定了肽鍵能級轉換的分裂。其中破壞-折疊所需能量大于-螺旋，所以h-FVP-SPI水凝膠穩定性高于SPI，FVP能提高SPI水凝膠的穩定性。維持蛋白質二級結構的主要作用力是分子內氫鍵和二硫鍵。-折疊是羰基氧（—C＝O）與相同或相鄰的肽鏈酰胺氫（—CONH—）之間通過肽鍵形成的規則氫鍵。加入FVP后和熱處理后，各水凝膠的二級結構均有所變化，這說明FVP的加入和熱處理能改變SPI水凝膠的氫鍵和二硫鍵結構。FVP可以通過與SPI分子的靜電和共價鍵的方式改善水凝膠的結構，提高SPI水凝膠的機械能。

表2 不同水凝膠中SPI二級結構的變化Table 2 Secondary structure contents of soy protein in different hydrogels

2.4.2 FVP對SPI水凝膠三級結構的影響

由圖3可知，與SPI水凝膠相比，h-SPI水凝膠的最大熒光強度增加，并伴有最大熒光強度對應波長（）的輕微藍移；FVP加入后，h-SPI水凝膠的最大熒光強度進一步提高（h-FVP-SPI）。這表明FVP和SPI水凝膠在加熱條件下的靜電或共價結合改變了SPI的折疊狀態。蛋白質中芳香族氨基酸殘基可以被280 nm的紫外線激發出熒光。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸帶有不同的側鏈基團，具有不同的熒光光譜，其中色氨酸熒光強度最強。色氨酸的熒光發射很容易受到某些因素影響而改變，包括相鄰位置的氨基酸殘基、用于溶解蛋白質的溶劑以及色氨酸殘基在整個蛋白質高級結構中的位置。蛋白質中經常發生從酪氨酸到色氨酸殘基的能量轉移，導致酪氨酸殘基的熒光淬滅和色氨酸殘基的熒光增加。熱處理及FVP對SPI水凝膠熒光強度的增加表明，熱處理和FVP改變了SPI的三級結構；其中，色氨酸作為一種疏水性氨基酸，在疏水性增強的過程中逐漸被安排在蛋白質分子的外側，使SPI內部的色氨酸殘留物逐漸暴露在SPI分子的表面上。

圖3 不同水凝膠熒光強度的變化Fig.3 Fluorescence intensity of different hydrogels

2.4.3 FVP對SPI水凝膠分子間作用力的影響

如圖4所示，疏水相互作用、二硫鍵和靜電相互作用是形成h-FVP-SPI復合水凝膠的主導力，這個結果與Wang Wenjie等的報道相似。在熱處理或添加FVP后，SPI水凝膠的靜電相互作用、氫鍵都得到了明顯的加強；熱處理也能使SPI水凝膠的二硫鍵作用得到顯著增強。FVP是一種帶負電荷的多糖，而SPI帶正電荷，FVP與SPI的加熱混合促進了靜電相互作用的發生。因此，靜電作用在h-FVP-SPI水凝膠網絡的形成中發揮了主要作用，這種靜電相互作用的增強可以被用于解釋持水性的增強。此外，由于FVP的加入引入了大量的—OH，使得氫鍵的作用增強，這導致親水作用的減弱和疏水能力的增強，疏水相互作用結果與熒光光譜的結果一致。二硫鍵的形成可能會影響蛋白質結構的穩定性和疏水性，所以后續進行了水凝膠表面疏水性的測定。

圖4 不同水凝膠在不同溶劑下的溶解度Fig.4 Solubility of different hydrogels in different solvents

2.4.4 FVP對SPI水凝膠巰基含量的影響

如圖5所示，各水凝膠的總巰基含量無顯著差異（＜0.05），說明不同處理下的水凝膠總巰基含量無變化。熱處理后水凝膠的游離巰基含量顯著高于未加熱水凝膠。游離巰基含量是衡量蛋白質聚集的指標。由于蛋白質結構中共價鍵中裂解能量最低的屬于二硫鍵和C—S鍵，加熱至90 ℃的過程能夠使-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白變性，11S大豆球蛋白中至少有20 個二硫基，在蛋白質變性時易發生變化，并且大豆球蛋白酸性和堿性多肽之間的S—S被破壞，引發巰基-二巰基交換反應。此外，h-FVP-SPI水凝膠與h-XG-SPI水凝膠中游離巰基含量顯著高于h-SPI，這表明在FVP和XG加入后，二硫鍵介導的交聯更少，或者兩種多糖的加入抑制了巰基的氧化。由于多糖中硫酸酯、硫醇基團的引入，在加熱過程中二硫鍵和硫醇-二硫化物的互換增加了蛋白質中多肽鏈的表觀鏈長，從而影響蛋白質凝膠化過程。熱處理后水凝膠游離巰基含量增加的結果與分子間作用力中巰基作用的結果相互驗證。

圖5 不同水凝膠的游離巰基與總巰基含量Fig.5 Contents of free sulfhydryl group and total sulfhydryl group in different hydrogels

2.4.5 FVP對SPI水凝膠表面疏水性的影響

如圖6所示，加入FVP和熱處理均能顯著提高SPI水凝膠的表面疏水性。熱處理后水凝膠的表面疏水性顯著高于未熱處理的水凝膠（＜0.05），這是由于大多數非極性氨基酸可以形成疏水性核心并掩藏在蛋白質內部，而熱處理促使蛋白質的疏水性氨基酸暴露，此結果與溶解度測定結果一致。蛋白質的表面疏水性取決于其分子質量、形狀、分子內和分子間交聯以及氨基酸的組成和排列。ANS和蛋白表面疏水區域結合后產生的熒光變化能反映暴露在蛋白質分子表面疏水基團的數量，這很大程度決定了蛋白質溶解性。表面疏水性的增加表明熱處理及添加FVP降低了SPI水凝膠的溶解性，這與蛋白質三級結構的結果中疏水性氨基酸向蛋白質表面排列的結果相互驗證，與疏水相互作用結果一致。

圖6 不同配方水凝膠的表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity of different hydrogels

3 結論

添加5% FVP并通過90 ℃水浴加熱30min制備FVPSPI水凝膠。在加熱過程中，SPI發生熱變性，發生不可逆的化學交聯形成更為致密的網絡結構。疏水相互作用、二硫鍵和靜電相互作用是形成h-FVP-SPI復合水凝膠的主導力。從二級結構上，FVP大量—OH的引入導致氫鍵的增加使-螺旋向-折疊轉變，二硫鍵的增加同時影響二級結構并伴隨著三級結構的變化，使h-FVP-SPI水凝膠表面疏水性增大，凝膠強度和熱穩定性得到顯著提高。FVP對SPI水凝膠的穩定性和持水性的增強作用與XG無差異顯著性，熱穩定性顯著提高。本實驗為高活性菌物多糖在SPI水凝膠的應用提供了一定理論依據。