基于玉米醇溶蛋白/沒食子酸復合納米顆粒提升玉米油Pickering乳液的氧化穩定性

葛思彤，李 琦，賈 睿，劉 偉，劉美宏，劉回民，鄭明珠，蔡 丹，劉景圣

（吉林農業大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

Pickering乳液是一種利用固體顆粒代替表面活性劑對于油水界面進行穩定而形成的乳液，與傳統乳液相比，其成本低、對環境污染小。由于固體顆粒之間存在靜電斥力，使得液滴之間彼此保持一定的距離，能夠與油水界面形成穩定的三維網狀結構。此外，固體顆粒在油水界面的吸附行為是不可逆的，從而使得Pickering乳液的穩定性良好，且具有抗Ostwald熟化的能力。玉米醇溶蛋白（Zein）基固體顆粒是近年來穩定Pickering乳液較為常見的原料，Zhang Wei等利用Zein-果膠復合納米顆粒穩定的Pickering乳液，在高油量分數（=0.6）下乳液呈現出長期貯藏穩定性。此外，Zein/殼聚糖復合顆粒也被證實是有效的Pickering乳液乳化穩定劑，形成的乳液在9 個月的貯藏期間具有較強的抗絮凝能力。Liu Xiao等利用Zein和麥醇溶蛋白形成的復合顆粒作為Pickering乳液的穩定劑，顆粒可以在油水界面形成難以被破壞的界面層，使得乳液具有良好的黏彈性和貯藏穩定性。這些研究表明，Zein基固體顆粒穩定Pickering乳液具有良好的發展前景。

Zein是玉米中的主要貯藏蛋白，具有強疏水性，可以溶于60%～95%的乙醇溶液，具有良好的生物相容性和可降解性。眾多學者研究表明，通過Zein的兩親特性及自組裝能力可以成功制備納米顆粒、納米乳液等生物遞送體系，從而實現對于生物活性物質的包埋與遞送。目前許多研究利用多糖、多酚、表面活性劑等對Zein進行修飾，以期獲得更加穩定的Zein基遞送體系。其中，利用多酚對蛋白質進行修飾的研究備受關注。前期研究表明，蛋白質和多酚可以通過非共價方式進行結合，進而改變Zein的功能與結構特性，此時二者之間的作用力主要集中于氫鍵、疏水鍵等非共價鍵，是一種可逆的相互作用。同時多酚的加入也可以在一定程度上抑制貯藏過程中Pickering乳液脂質氧化現象的發生，以期延長乳液的貯藏時間。沒食子酸（gallic acid，GA）是白色或者淡黃色的結晶或粉末狀物質，廣泛應用于食品、藥品等行業。根據前期研究，GA具有抗炎、抗腫瘤等作用，同時還可以清除自由基，具有一定的抗氧化活性，屬于常見的多酚類物質。同時，GA可以與蛋白質、多糖等物質進行非共價結合。目前，應用醇溶性蛋白質和多酚進行非共價結合的研究較少，多酚的加入對于醇溶性蛋白理化性質的影響有待探究。

本研究利用GA對于醇溶性蛋白質進行修飾，通過非共價結合的方式制備出玉米醇溶蛋白/沒食子酸復合納米顆粒（zein/gallic acid composite nanoparticles，ZGP），對形成納米顆粒的大小、微觀形態、結構、熱力學進行表征。進一步利用制備出的納米顆粒穩定Pickering乳液，并對乳液的液滴大小、Zeta電位、流變學特性以及貯藏期間的氧化穩定性能進行研究，為Zein的綜合利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Zein、GA 上海源葉生物科技有限公司；玉米油吉林省長春市沃爾瑪超市；去離子水為實驗室自制；透析袋（截留分子質量為12～14 kDa） 湖南翊博生物科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PC-620D磁力攪拌器 美國CORNING公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；ZS90粒徑分析儀 英國Malvern公司；Sigma300掃描電鏡 英國Zeiss公司；VERTEX 70傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，FTIR）光譜儀德國Bruker公司；D/MAX2500 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀 日本理學公司；Q2000差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）儀、等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry，ITC）儀美國TA公司；T18高速剪切機 德國IKA公司；MCR流變儀 奧地利安東帕（中國）有限公司；TH2-DT2H7 HiTemp Shaker 上海博彩生物科技有限公司；Fluostar omega酶標儀 德國BMG Labtech公司。

1.3 方法

1.3.1 ZGP的制備

制備質量濃度為2 g/100 mL的Zein-乙醇溶液40 mL（體積分數70%），磁力攪拌2 h后放于4 ℃貯藏過夜，保證Zein充分水合。將GA溶于去離子水中（100 mL），Zein和GA質量比分別為1∶0～1∶0.5，充分攪拌至GA完全溶解。在1 000 r/min條件下將Zein溶液以細流狀倒入GA溶液中，并持續攪拌20 min。隨后將溶液透析處理12 h，以除去游離的多酚，每2 h更換一次透析液（70%乙醇溶液）。利用旋轉蒸發儀去除乙醇和一小部分水溶液（最終蛋白質量濃度為3 g/100 mL）。將制備得到的顆粒溶液放于4 ℃貯存并進行真空冷凍干燥獲得固體粉末狀顆粒。

1.3.2 ZGP顆粒粒徑、多分散指數（polymer dispersity index，PDI）與Zeta電位測定

參考Liang Xiao等的方法，將ZGP溶液稀釋20 倍后，在25 ℃、折射率1.330條件下利用ZS90粒徑分析儀進行粒徑、PDI值及Zeta電位測試。

1.3.3 ZGP微觀結構觀察

將冷凍干燥后的ZGP固體粉末狀樣品粘于導電膠上，進行噴金處理后利用場發射掃描電子顯微鏡在不同視野范圍內進行顆粒微觀結構觀察。

1.3.4 FTIR光譜分析

參考Chen Shuai等的方法，將ZGP固體粉末狀樣品與溴化鉀以1∶100的質量比進行混合后，在紅外光照射下于研缽中研磨成均勻粉末。利用壓片機將研磨后的粉末壓成薄片后，在400～4 500 cm條件下進行掃描。

1.3.5 XRD分析

將ZGP固體粉末狀樣品平鋪于玻璃板上，通過XRD儀考察加入GA對Zein晶體結構的影響。在25 ℃條件下進行測定，樣品掃描范圍5°～45°（掃描速率5°/min）。

1.3.6 熱特性分析

1.3.6.1 ITC分析

參考Dai Taotao等的方法，進行Zein和GA之間相互作用的熱力學參數測定與分析。將Zein-乙醇溶液通過反溶劑法，并通過旋蒸后得到Zein懸浮液。隨后利用去離子水溶解GA，得到1 mg/mL GA溶液。在25 ℃條件下，將300 μL的Zein溶液放于反應池，利用注射器吸取50 μL的GA溶液，設定19 個滴定體積，在250 r/min轉速下每次間隔120 s進行滴定。通過ITC儀器可以獲得結合常數（）、焓變（Δ）、熵變（Δ）和吉布斯自由能變化（Δ）以及結合位點數（）。

1.3.6.2 DSC分析

準確稱取5 mg的ZGP固體粉末狀樣品置于鋁制坩堝中密封壓緊，以空白鋁盒作為空白對照。在溫度范圍30～180 ℃，升溫速率為10 ℃/min條件下對樣品進行DSC分析。

1.3.7 表面疏水性分析

利用ANS熒光探針法，將8 mmol/L的ANS溶解于PBS中（10 mmol/L，pH 7.0）。隨后利用PBS稀釋ZGP樣品溶液至蛋白質量分數為0.015%～0.030%。將20 μL的ANS溶液加入4 mL樣品中充分混合，隨后在激發波長390 nm、發射波長400～700 nm處測定熒光強度。表面疏水性利用熒光強度和樣品濃度的線性回歸斜率表示。

1.3.8 由ZGP穩定的Pickering乳液的制備

將制備好的ZGP溶液作為水相，利用玉米油作為油相，二者以體積比1∶1混合后利用高速剪切機在10 000 r/min均質2 min，獲得由ZGP穩定的Pickering乳液。

1.3.9 Pickering乳液的液滴粒徑與電位分析

將Pickering乳液稀釋20 倍后置于測試的比色皿中，利用ZS90粒徑分析儀進行液滴粒徑和Zeta電位測試（水的折射率為1.330，玉米油折射率1.470，溫度25 ℃）。

1.3.10 Pickering乳液流變學分析

參考李夢帆的方法，對于Pickering乳液進行振蕩掃描和頻率掃描測定。將制備好的乳液均勻鋪在加熱板上，在0.5 Hz頻率下，測定0～100 s剪切速率范圍下的黏彈性模量。同時在1 Pa壓力下，測定10～100 Hz范圍內儲能模量（′）與損耗模量（′′）的變化。

1.3.11 Pickering乳液貯藏期間氧化穩定性分析

為判斷GA對Pickering乳液貯藏期油脂氧化的影響，在貯藏期間（50 ℃、20 d）對不同乳液狀樣品的初級氧化產物（脂質氫過氧化物）和次級氧化產物（丙二醛）產生量進行測定。

1.3.11.1 初級氧化產物

參考Meng Ran等方法，將0.3 mL的乳液樣品分裝在2 mL離心管中，加入1.5 mL的萃取液1（異辛烷-異丙醇（3∶1，/）），隨后持續振蕩1 min。混合物在4 500 r/min離心5 min后，收集200 μL的有機相并加入2.8 mL萃取液2（甲醇-正丁醇（2∶1，/））、15 μL硫氰酸銨（3.94 mol/L）、50 μL鐵離子溶液（0.132 mol/L氯化鋇和0.144 mol/L硫酸亞鐵以1∶1體積比混合），在黑暗處反應20 min后，利用酶標儀在510 nm波長處測定吸光度。最終利用過氧化氫異丙苯標準曲線判斷初級氧化產物含量。

1.3.11.2 次級氧化產物

采用丙二醛含量代表次級氧化產物含量。將1 mL乳液與2 mL的硫代巴比妥酸溶液混合（將15 g三氯乙酸、0.375 g硫代巴比妥酸、0.025 mol/L的鹽酸溶解于100 mL蒸餾水中）。隨后在沸水中煮沸20 min，恢復至室溫后，7 000 r/min離心40 min，收集上清液后在532 nm波長處測定吸光度。丙二醛含量根據1,1,3,3-四乙氧基丙烷標準曲線進行測定。

1.4 數據處理

利用Origin 8.0和GraphPad Prism 7軟件作圖，通過SPSS和GraphPad Prism 7進行顯著性分析，＜0.05，差異顯著（≥3）。

2 結果與分析

2.1 ZGP理化性質分析

由圖1a可知，ZGP的顆粒粒徑集中在納米級別，且呈現單一分散性。圖1b中ZGP的平均粒徑值呈現先上升后下降的狀態，PDI值均低于0.4證明顆粒分散液的分散性質良好。Zeta電位由粒子與粒子之間的相互作用形成，是評價膠體分散體系穩定性能的重要指標。Zein和GA通過非共價結合發生了相互作用，根據圖1c結果表明，ZGP顆粒的Zeta電位值均為正值，說明形成的顆粒分散液pH值低于Zein等電點。Zein與GA結合后，隨著GA添加量增加，ZGP顆粒的Zeta電位值整體呈上升趨勢，說明Zein表面電荷增加，顆粒之間的靜電排斥力增強。在Zein與GA質量比為1∶0.5時Zeta電位值達到最高，達到46.6 mV。

圖1 ZGP的粒徑分布（a）、平均粒徑與PDI（b）、Zeta電位（c）Fig.1 Particle size distribution (a),average particle size and polydisperse index (b),zeta potential (c) of zein/gallic acid composite nanoparticles

通過掃描電鏡對ZGP的微觀結構進行觀察，結果如圖2所示。其中，未加入GA的顆粒（圖2a）表面并不光滑且形狀不規則，而隨著GA添加量的逐漸增加，顆粒逐漸趨于光滑平整的圓球狀。說明了多酚類物質的加入可以對蛋白質的自組裝現象產生影響，二者之間的相互作用（如氫鍵、靜電相互作用等）可能發生改變。

圖2 ZGP微觀結構Fig.2 Microstructure of zein/gallic acid composite nanoparticles

2.2 ZGP相互作用與結構分析

FTIR光譜能夠通過峰的位移和強度變化判斷物質相互作用方式和程度。通常來講，Zein的三大特征峰分別出現在酰胺A帶（3 100～3 500 cm）、酰胺I（1 750～1 600 cm）和酰胺II帶（1 550～1 510 cm），分別代表N—H鍵的拉伸與氫鍵變化、C＝O鍵伸縮振動、C—N彎曲和N—H彎曲。GA的特征峰出現在3 496 cm和3 278 cm，分別對應O—H鍵的振動拉伸。1 608～1 386 cm主要歸因于芳香環C—C或C—H鍵的拉伸與彎曲振動。1 315～1 218 cm對應酚醇的O—H鍵；1 024～634 cm對應C—O鍵的拉伸和彎曲振動。如圖3a所示，與GA特征峰相比，形成的復合納米顆粒在3 496 cm處GA的特征尖峰消失；與Zein組和1∶0對照組相比，在1 097 cm處出現了屬于GA的特征吸收峰。同時，隨著GA添加量的增加，ZGP的酰胺A帶出現了較為明顯的紅移現象，說明二者之間發生了結合，且主要作用力為氫鍵。

圖3 ZGP的FTIR光譜（a）和XRD（b）分析Fig.3 FTIR (a) and XRD (b) analysis of zein/gallic acid composite nanoparticles

如圖3b所示，單一Zein的XRD衍射角2分別出現在9.09°和19.20°，這與之前的研究結果一致。單一的GA XRD衍射峰呈現多尖峰的形態，表明其具有定向有序排列的高度結晶結構。由ZGP顆粒的XRD圖可以看出，GA的特征結晶峰幾乎完全消失。該結果表明，GA與Zein復合后，可能以無定型狀態分布于復合物基質中。XRD和FTIR的結果在一定程度上具有一致性。

2.3 ZGP熱力學分析

通過DSC實驗可以對ZGP顆粒熱穩定性的變化進行檢測。如圖4a所示，Zein的初始變性溫度和變性峰值溫度分別為43.31、81.31 ℃。隨著GA添加量逐漸增加，當Zein與GA質量比為1∶0.5時，初始變性溫度和變性峰值溫度分別達到51.77、89.91 ℃。這說明GA的加入可能改變了Zein的結構，在一定程度上可以提升Zein的親水力，從而提升其熱變性溫度，增強其熱穩定性。

圖4 ZGP的DSC（a）和ITC（b、c）圖譜Fig.4 DSC (a) and ITC (b,c) analysis of zein/gallic acid composite nanoparticles

圖4b、c展示了GA滴定Zein時體系發生的熱焓值變化。當反應開始時，整個體系開始釋放熱量，隨著GA的逐漸加入，整個體系釋放的熱量逐漸減少。當滴到第15～19滴時反應放熱逐漸趨于平緩狀態，說明二者反應達到飽和。根據Δ＜0，說明二者之間高度放熱；根據Δ＜0，說明二者之間能夠自發完成相互作用；根據Δ＜0，說明二者之間的相互作用主要為焓驅動而不是熵驅動。根據=8.97×10，說明二者之間的結合常數較高。該熱力學結果也證明了Zein與GA二者之間的反應遵循熱力學第二定律。

2.4 ZGP表面性質分析

前期研究表明，多酚可以改變Zein的結構，通過影響其表面疏水性調節Zein的自組裝能力。通過圖5可以觀察到，隨著多酚添加量的增多，表面疏水性呈顯著降低的現象。說明多酚的添加可以引入親水基團降低表面疏水性。Zou Yuan等的前期研究也證明，隨著單寧酸這一酚類物質添加量增多，形成顆粒溶液的表面疏水性也呈現逐漸下降的趨勢，證明了多酚的加入會對蛋白質的表面性質進行調控。

圖5 ZGP表面疏水性分析Fig.5 Surface hydrophobicity analysis of zein/gallic acid composite nanoparticles

2.5 ZGP穩定的Pickering乳液理化性質分析

根據圖6a可知，Zein與GA質量比1∶0對照組乳液液滴粒徑為（317.1±0.85）nm，而添加GA的乳液液滴粒徑均集中于200 nm以下，PDI值低也證明了由ZGP穩定的Pickering乳液的分散性較好。與1∶0對照組相比，經過高速剪切處理后，GA的加入會導致乳液液滴大小呈下降趨勢。多酚類物質可能分布在界面層，液滴被覆蓋，脂質液滴絮凝現象減弱。通過圖6b也發現，電位值均為正值，證明此時乳液的pH值低于Zein等電點。

圖6 ZGP穩定Pickering乳液的液滴粒徑和PDI（a）、Zeta電位分析（b）Fig.6 Droplet size and polydisperse index (a) and zeta potential (b) of zein/gallic acid composite nanoparticles stabilize Pickering emulsions

Pickering乳液的流變學行為是表征Pickering乳液物理特性的必要手段。根據圖7a中′和″可以判斷，相同條件下，′均高于″，說明該乳液在外力作用下發生形變的可能性低，這可能與顆粒包裹的液滴形成的三維網絡結構有關。從圖7b結果也可以發現，隨著剪切速率的逐漸上升，乳液黏度值逐漸下降，呈現出典型的剪切稀化現象，說明由ZGP顆粒穩定的Pickering乳液屬于非牛頓流體。

圖7 ZGP穩定Pickering乳液的流變學特性Fig.7 Rheological properties of zein/gallic acid composite nanoparticles stabilized Pickering emulsions

2.6 ZGP穩定的Pickering乳液氧化穩定性分析

油脂氧化會影響Pickering乳液的貯藏壽命。將由ZGP穩定的Pickering乳液放于50 ℃培養箱中加速氧化20 d，判斷其在貯藏期間的初級氧化產物（氫過氧化物）和次級氧化產物（丙二醛）生成量變化（圖8）。總體來說，GA的添加在一定程度上抑制了Pickering乳液的油脂氧化現象。在貯藏期內，所有組別的氫過氧化物值均有所上升，證明油脂在貯藏期間發生了氧化。隨著GA添加量的逐漸增多，氫過氧化物值有所下降，從（21.69±0.2）mmol/L下降至（8.43±0.01）mmol/L（Zein與GA質量比1∶0.5）。其次，丙二醛生成量變化與氫過氧化物的生成量趨勢基本一致，隨著GA添加量增大，丙二醛生成量呈劑量依賴性下降，從（5.65±0.04）mmol/L下降至（2.60±0.02）mmol/L（Zein與GA質量比1∶0.5）。說明了與對照組Pickering乳液相比，ZGP穩定的Pickering乳液在一定程度上可以抑制貯藏期間產生的油脂氧化現象。由于GA的抗氧化活性中心主要集中在酚羥基，該基團的存在可以與油脂氧化產生的自由基結合，從而抑制油脂氧化現象的發生。此外，ZGP能夠有效吸附在液滴周圍形成穩定的抗氧化屏障，增加乳液的界面層厚度，提升乳液的空間位阻效應。同時可以阻止水相中促氧化物質進入油相，進而乳液體系的氧化穩定性有所提升。

圖8 ZGP穩定Pickering乳液的初級氧化產物（a）和次級氧化產物（b）Fig.8 Generation of primary (a) and secondary (b) oxidant products in zein/gallic acid composite nanoparticles stabilized Pickering emulsions during accelerated storage

3 結論

成功制備ZGP，其粒徑較小，GA的加入使得顆粒逐漸呈現光滑的圓球狀。FTIR和XRD結果表明Zein與GA之間的作用力主要為氫鍵，二者結合后特征峰的改變證明了復合成功。熱力學實驗研究結果可知，Zein和GA之間為自發放熱反應，而且隨著GA添加量的增多，增強了復合納米顆粒的熱穩定性能。利用ZGP穩定Pickering乳液，結果發現乳液的液滴大小集中在納米級別，呈剪切稀化現象，屬于非牛頓流體。此外，由ZGP穩定的Pickering乳液在加速氧化期間展示出較好的氧化穩定性，具有抑制油脂氧化現象發生的能力。本研究結果可以為Zein的綜合利用提供理論基礎，并為脂溶性生物活性物質的包埋與遞送提供新思路。