白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的制備及表征

胡小寧，李 甜，屈 陽，郭 芹，李寧陽，唐曉珍,，王 強,

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271000；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

凝膠油是一種新型的塑性脂肪，成為可替代傳統固態脂肪應用的健康脂肪類型，在食品、醫藥和化妝品領域極具應用前景和潛力。其由單一或復合凝膠劑通過自組裝或者結晶模式形成三維網絡結構進而將液態油脂（如植物油）轉變為具有熱可逆的類固體脂肪物質，有結晶模式和分子自組裝模式2 種，不僅最大程度保留液態油中植物甾醇、VE等營養元素，還兼具低反式脂肪酸和飽和脂肪酸等突出優點，成為健康油脂研究的熱點。

目前，制備凝膠油的方法有加熱冷卻法和乳液模板法，其中最常用的是加熱冷卻法，即少量凝膠劑在親脂性液體（通常是植物油）中加熱攪拌一段時間，再冷卻至室溫或室溫以下。目前常見的凝膠劑有天然蠟（蜂蠟、米糠蠟和蟲蠟等）、乙基纖維素、單甘酯、谷維素和谷甾醇的混合物等，其中天然蠟具有成本低、結合能力好、持油性強等優點。天然蜂蠟是由工蜂蠟腺分泌的復雜有機化合物，熔點為62～65 ℃，廣泛應用于食品工業，但單獨用蜂蠟制備的凝膠油即使在臨界凝膠濃度下仍存在硬度和黏度過大、不易涂抹、觸變性差等問題，產業化應用面臨一定挑戰，尋找合適的蜂蠟復配劑是獲得特定功能化凝膠油的關鍵。

白藜蘆醇又稱芪三酚，是一種存在于虎杖、花生、葡萄等植物中的非黃酮類多酚化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用，但存在熔點高、脂溶性差、靶點多、生物利用度低等問題，限制了其在食品領域的應用。為了解決蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇現存問題，本實驗以花生油為基料油，采用9,11-共軛亞油酸酯化改性白藜蘆醇，并與蜂蠟復配制備白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油，采用X射線衍射儀、流變儀、氣相色譜儀、偏振光顯微鏡等方法對其基本理化性能、熱性能及組成成分進行表征，以期研發出富含白藜蘆醇共軛亞油酸酯的功能性凝膠油產品，為其產業化應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇（99%）、9,11-共軛亞油酸（80%）、,′-羰基二咪唑（99%）和二氯甲烷（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；正己烷、乙酸乙酯、冰乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；GF254薄層層析硅膠板 青島海洋化工有限公司；魯花5S壓榨一級花生油 山東魯花集團有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004電子分析天平 上海上平儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；RE52CS旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；SHZ-D循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；GF254薄層層析硅膠板 青島海洋化工有限公司；Eclipse E200 POL偏光顯微鏡 日本尼康有限公司；CR-400色差儀 日本Konica Minolta公司；X-射線衍射儀 英國馬爾文公司；MCR302/MCR102模塊化智能型高級流變儀 奧地利Anton Paar公司。

1.3 方法

1.3.1 白藜蘆醇共軛亞油酸酯的制備

按照9,11-共軛亞油酸和′-羰基二咪唑物質的量比1∶1稱取9,11-共軛亞油酸于錐形瓶中，加入,′-羰基二咪唑后再加入適量二氯甲烷使其完全溶解，室溫攪拌反應30 min。按醇酸物質的量比1∶3稱取白藜蘆醇，滴入上述反應液反應1 h，即得白藜蘆醇酯粗品，將其用適量蒸餾水洗滌多次，直至上層液體無色澄清，再用無水乙醇洗滌多次，除去多余白藜蘆醇和共軛亞油酸，分液得有機相，加少量無水硫酸鈉攪拌過夜，抽濾2 次，再旋蒸除去二氯甲烷，最后經真空冷凍干燥后即得白藜蘆醇共軛亞油酸酯純品。

1.3.2 白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油和蜂蠟凝膠油的制備

分別稱取花生油5 份，每份10.0 g加入到5 個燒杯中，然后向燒杯中按照蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比7∶3加入，使其蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量分數（beeswax-resveratrol conjugated linoleate concentration，BRE）分別為6%、8%、10%、12%、14%，將燒杯放入70 ℃恒溫水浴鍋中加熱攪拌10 min，使燒杯中蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯完全溶解，再冷卻至室溫保存，得到白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油。將優選的BRE作為固定數值，依次考察蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比（5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）、加熱溫度（60、70、80、90、100 ℃）、加熱時間（10、20、30、40、50 min）、冷卻溫度（4、15、25 ℃）對凝膠油持油性的影響，逐次篩選各因素最佳條件。以未添加白藜蘆醇共軛亞油酸酯的蜂蠟制備的蜂蠟凝膠油為對照。

1.3.3 凝膠油持油性的測定

移取1.0 g凝膠油置于事先稱質量（記為）的離心管中，然后將樣品放入0 ℃冰箱過夜后置于25 ℃恒溫培養箱中貯藏數天，稱質量（記為），樣品10 000 r/min離心15 min，倒置樣品10 min，使離心出的油析出，并用脫脂棉將壁管上殘留的油擦除，稱其質量記為，做3 次平行實驗，取平均值。按式（1）計算持油性：

1.3.4 檢測指標分析

1.3.4.1 白藜蘆醇共軛亞油酸酯的鑒定

傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）檢測：將純化后樣品、白藜蘆醇和9,11-共軛亞油酸采用FTIR進行測定，以16 cm的分辨率進行64 次掃描，記錄500～4 500 cm范圍內的譜圖。

薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）檢測：首先將酯化改性過程采用TLC（正己烷-乙酸乙酯-冰乙酸，10∶8∶0.1，/）進行監測，然后分別將白藜蘆醇和9,11-共軛亞油酸溶于二氯甲烷在同樣的展開劑比例下展開，并在波長254 nm紫外燈下顯色，將其與反應后樣品點進行對照。

1.3.4.2 凝膠油的表征

黏度測定：使用智能化模塊流變儀研究凝膠油的黏度。流變測定方法：溫度設定25 ℃，剪切速率從0 r/s到300 r/s，記錄點個數為60。

色度測定：凝膠油樣品的顏色采用色差儀進行測量。其中表示亮度：正值代表亮色，負值代表暗色。值正值代表紅色，負值代表綠色。值正值代表黃色，負值代表藍色。標準板為=93.35、=-0.07及=2.66。總色差用Δ表示，Δ＜1，代表人眼可分辨的色差不明顯；1＜Δ＜3代表人眼能夠辨別出細微的色差；Δ＞3代表人眼能明顯分辨出色差。每個樣重復3 次，按式（2）計算色差值：

固體脂肪含量（solid fat content，SFC）測定：采用低場脈沖核磁共振（nuclear magnetic resonance，pNMR）儀測定樣品結晶過程中SFC。稱取5 mg凝膠油放入pNMR專用試管中，于90 ℃下融化30 min以消除結晶記憶，然后再0 ℃低溫恒溫槽中保留90 min，再測其SFC，然后升溫到23 ℃，測定其SFC。

三相接觸角測定：將凝膠油用鋒利的刀片切平后置于接觸角測試儀的樣品臺上，將5 μL水滴與凝膠油樣品接觸，測試接觸角大小，同時進行接觸角照片采集，實驗結果為測試樣品上5 個不同位置的平均值。按式（3）計算固-氣間界面張力：

式中：為固-氣間界面張力；為固-液間界面張力；為液-氣間界面張力；為固-液-氣三相平衡時接觸角；＜90°為親液表面，角越小，越容易濕潤；＞90°為疏液表面，角越大，越難濕潤；＞150°稱為超疏液表面。

凝膠油的結晶形態分析：采用普通光學顯微鏡和偏光顯微鏡對兩種凝膠油的晶體微觀結構進行觀察研究，先制片，用毛細管取一定量凝膠油放在載玻片上，從一個方向蓋上蓋玻片，防止氣泡殘留，置于載物臺上，觀察凝膠油中結晶形態。

凝膠油的晶型分析：稱取適量凝膠油樣品平鋪在樣品架上，在常溫下通過X射線衍射儀測定待測樣品的晶型。相關參數：銅鈀，40 kV，40 mA，掃描速率4°/min，掃描范圍5°～90°。通過布拉格方程計算間距：＝/（2sin）。為Cu-Kα射線的波長，2為衍射角，采用MDI Jade 6.5軟件進行數據分析。

脂肪酸組成測定：參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》第三法測定凝膠油脂肪酸組成。

1.4 數據處理

實驗數據用3 次重復實驗取得的平均值表示，采用SPSS 25.0軟件進行方差分析以及多重比較分析，＜0.05，差異顯著，并利用Origin 2018軟件處理實驗所得數據及畫圖。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇共軛亞油酸酯的結構鑒定

FTIR用于鑒定白藜蘆醇和白藜蘆醇共軛亞油酸酯的分子結構，白藜蘆醇在3 200 cm有酚羥基的伸縮振動吸收峰（圖1A），而白藜蘆醇酯FTIR譜圖3 200 cm處的峰消失（圖1B），說明白藜蘆醇的酚羥基發生了反應。從圖1B可知，1 760 cm和1 122 cm處的強峰分別來自C＝O和C—O（C—O—C）的伸縮振動，這表明有酯鍵形成；同時，在2 923 cm和2 854 cm處出現了—C—H(CH)反對稱與對稱伸縮振動強吸收峰，說明體系有不飽和脂肪鏈；此外，1 600 cm處有芳環C＝C伸縮振動峰。以上結果表明白藜蘆醇成功轉化為白藜蘆醇共軛亞油酸酯。

圖1 白藜蘆醇（A）和白藜蘆醇共軛亞油酸酯（B）的FTIR譜圖Fig.1 FTIR spectra of (A) resveratrol and (B) resveratrol conjugated linoleate

圖2硅膠板上可以看出成功合成了白藜蘆醇共軛亞油酸三酯，且白藜蘆醇和共軛亞油酸幾乎檢測不到，說明已純化完全。

圖2 純化后的白藜蘆醇共軛亞油酸酯TLC譜圖Fig.2 TLC profile of purified resveratrol conjugated linoleate

2.2 白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油最佳制備工藝確定

2.2.1 BRE對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響

由圖3可知，隨著BRE的上升，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的持油性逐漸增加。當BRE達12%，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的持油性為98%，BRE繼續增加，其持油性無顯著變化，說明BRE低于12%時，沒有形成凝膠油，BRE高于12%，增大了凝膠油的三維網絡結構緊密度，油結合能力增強。因此，從成本考慮選擇BRE為12%。

圖3 BRE對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響Fig.3 Effect of BRE concentration on the oil retention capacity of resveratrol conjugated linoleate oleogel

2.2.2 蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比對白藜蘆醇酯凝膠油持油性的影響

隨著蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比的增加，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的持油性逐漸增加后趨于穩定（圖4），即大量蜂蠟的存在會提高白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的穩定性。當蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比達到7∶3時，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的持油性為98.24%，蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比繼續增加，持油性基本不變。綜合考慮，選擇蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比為7∶3。

圖4 蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響Fig.4 Effect of mass ratio of beeswax to resveratrol conjugated linoleate on the oil retention capacity of resveratrol conjugated linoleate oleogel

2.2.3 加熱溫度對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響

如圖5所示，隨著加熱溫度的升高，持油性呈先上升后下降的趨勢。由于60 ℃時無法達到蜂蠟的熔點，在70 ℃時蜂蠟溶解更充分，使凝膠劑形成更加致密均勻的網絡結構。但過高的溫度會使花生油中的油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸產生反式結構，因此選擇70 ℃為最適加熱溫度。

圖5 加熱溫度對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響Fig.5 Effect of heating temperature on the oil retention capacity of resveratrol conjugated linoleate oleogel

2.2.4 加熱時間對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響

如圖6所示，隨著加熱時間的延長，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的持油性呈先上升后下降的趨勢。加熱時間從10 min延長至20 min，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的持油性從97.5%提高到98.1%，這可能是因為加熱時間的延長使凝膠劑充分溶解，凝膠因子能形成更加均勻、致密的網絡結構，體系結構化程度增大，骨架致密，束縛更多油相。當加熱時間從20 min延長至50 min，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性降低，這可能是由于過長的加熱時間導致凝膠體系內部自組裝程度降低，束縛的油相減少，并且長時間加熱可能會導致花生油發生氧化。綜合考慮，選擇加熱時間為20 min。

圖6 加熱時間對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響Fig.6 Effect of heating time on the oil retention capacity of resveratrol conjugated linoleate oleogel

2.2.5 冷卻溫度對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響

如圖7可知，隨著冷卻溫度的升高，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的持油性呈降低趨勢。4 ℃和15 ℃形成的凝膠油持油性接近100%，25 ℃形成的凝膠持油性僅有80%，說明凝膠劑添加量適當條件下，室溫不利于凝膠油的形成。原因可能是在較低溫度下，小分子凝膠劑間相互結合形成結晶，溫度越高，凝膠劑越不穩定，作用力減弱，結晶由大變小。溫度過高時無法形成足夠的結晶，液態油未被包裹導致油脂析出，持油性降低。說明溫度越高越不利于白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的形成。

圖7 冷卻溫度對白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油持油性的影響Fig.7 Effect of cooling temperature on the oil retention capacity of resveratrol conjugated linoleate oleogel

由以上分析可知，最適宜的凝膠油制備條件為：BRE 12%、蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比7∶3、加熱溫度70 ℃、加熱時間20 min、冷卻溫度4 ℃，在此條件下，持油性最高可達98.6%，因此，下述指標分析均在此條件下進行。

2.3 凝膠油基本理化性能分析

2.3.1 黏度分析

由圖8看出，2 種凝膠油的黏度隨著剪切速率的增加先快速下降后趨于穩定，但是蜂蠟凝膠油的初始黏度（7.7 Pa·s）大于白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油（4.6 Pa·s）。單一蜂蠟制備的凝膠油存在黏度過大的問題，影響凝膠油的外觀與口感。將白藜蘆醇共軛亞油酸酯與蜂蠟進行復配較蜂蠟凝膠油相比黏度降低30%，改善其外觀。

圖8 蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的黏度曲線Fig.8 Viscosity versus shear rate curves of beeswax oleogel and resveratrol conjugated linoleate oleogel

2.3.2 色度測定結果分析

如圖9所示，2 種凝膠油的值（明暗度）均低于花生（62），且存在顯著差異（＜0.05），即BRE的提高增加了體系的濁度，其中白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油值（51.85）低于蜂蠟凝膠油（58.37），說明其亮度降低，可能由于結晶網絡的光散射降低，從偏振光顯微鏡結果中也能看出添加了白藜蘆醇共軛亞油酸酯的凝膠油晶體數目有所降低；2 種凝膠油的都為負值且白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油值（-4.41）小于蜂蠟凝膠油（-4.70），說明白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的綠色被削弱；2 種凝膠油的值均為正值，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油值（15.96）高于蜂蠟凝膠油（15.69），說明其黃色程度越高。

圖9 蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的色度Fig.9 Color parameters of beeswax oleogel and resveratrol conjugated linoleate oleogel

2.3.3 SFC測定結果分析

在凝膠油體系中，雖然SFC不代表固體脂肪，但通過SFC的測定可反映其塑性，因此SFC是評價塑性脂肪可塑性的重要指標之一。在凝膠油體系中，構成樣品SFC的是凝膠劑而不是植物油，所以凝膠油的SFC不同是由于凝膠油中蜂蠟添加量不同導致的。由圖10可以看出，蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的SFC分別為9.2與9.8，表明白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油相較蜂蠟凝膠油可塑性更強，品質更好。

圖10 蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的SFCFig.10 SFC of beeswax oleogel and resveratrol conjugated linoleate oleogel

2.3.4 三相接觸角測定結果分析

圖11顯示出白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的接觸角（64.8°）小于蜂蠟接觸角（85.6°），從凝膠油的接觸角可以反映凝膠油的濕潤性，=0°，完全濕潤；＜90°部分濕潤；=90°是濕潤與否的分界線；＞90°不濕潤。可以看出白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油相較蜂蠟凝膠油更容易被水相濕潤，蜂蠟凝膠油的接觸角較大由于其結晶數目多，晶體結構更為緊密，與偏振光顯微鏡分析結果一致。

圖11 白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油（A）和蜂蠟凝膠油（B）的接觸角分析Fig.11 Analysis of contact angle of resveratrol conjugated linoleate oleogel (A) and beeswax oleogel (B)

2.4 凝膠油晶體結構分析

2.4.1 凝膠油的偏振光顯微鏡分析

由圖12可以看出，僅由蜂蠟制備的凝膠油呈現長針狀網絡，加入了白藜蘆醇共軛亞油酸酯的凝膠油雖然結晶數量略有減少，但是仍可形成均勻的針狀結晶、狀態良好的凝膠油，長針狀晶狀結構可更好地使晶體間交聯形成三維網絡，從而截留更多的液態油脂。

圖12 蜂蠟凝膠油在100 倍（A）和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油100 倍（B）偏振光顯微鏡下影像Fig.12 Polarized light micrographs of beeswax oleogel at ×100 (A)and resveratrol conjugated linoleate oleogel at ×100 (B)

2.4.2 凝膠油X射線衍射分析

由圖13可以看出，凝膠油在不同區域出現了不同的衍射峰，說明凝膠油存在同質多晶現象。衍射峰在4.1 ?為型晶體的特征峰，3.7 ?和4.1 ?附近強衍射峰為型晶體的特征峰，4.6 ?附近的強衍射峰為型晶體的特征峰。蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油均有3 個特征峰，其中一個特征峰的值接近3.7 ?，另外特征峰的值近4.1 ?和4.6 ?，所以2 種凝膠油的結晶結構均為、晶型和晶型的混合。白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的晶型數量低于蜂蠟凝膠油，型晶體的存在可能會導致黏度恢復值降低；可以看出，白藜蘆醇共軛亞油酸酯的加入沒有影響整個體系的晶型，晶型的減少使其黏度恢復值上升，提高產品質量。

圖13 蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的X射線衍射Fig.13 XRD profile of beeswax oleogel and resveratrol conjugated linoleate oleogel

2.5 凝膠油脂肪酸組成分析

表1為傳統蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的脂肪酸組成，蜂蠟凝膠油的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸質量分數分別為20.708 1%、50.544 0%、28.647 9%，白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸質量分數分別為18.516 0%、49.749 7%、31.770 0%，添加白藜蘆醇共軛亞油酸酯的凝膠油飽和脂肪酸降低了2.2%，多不飽和脂肪酸提高了3.1%，并且無反式脂肪酸生成。

表1 蜂蠟凝膠油和白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的脂肪酸組成Table 1 Fatty acid composition of beeswax oleogel and resveratrol conjugated linoleate oleogel

3 結論

以花生油為基料油，利用9,11-共軛亞油酸酯化改性白藜蘆醇，并與蜂蠟復配制備白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油，最佳制備工藝為BRE 12%、蜂蠟與白藜蘆醇共軛亞油酸酯質量比7∶3、加熱溫度70 ℃、加熱時間20 min、冷卻溫度4 ℃，在此工藝下白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油的持油性最高可達98.6%，與蜂蠟凝膠油相比黏度降低30%、亮度降低、減少了型晶體，并發現白藜蘆醇共軛亞油酸酯凝膠油單不飽和脂肪酸降低2.2%，多不飽和脂肪酸提高了3.1%，并且無反式脂肪酸生成。本研究為開發功能性凝膠油提供理論依據，對食品的多樣性和安全性具有重要意義。