綠豆RS4·Se（IV）制備、結構表征及對酶活抑制動力學

趙姝婷，王維浩,2，全志剛，王 娟，劉德志，王一飛，武云嬌，蘇有韜，魏春紅，曹龍奎,2,3,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省天然產物模擬移動床色譜分離技術創新中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆原產于亞洲的印度東北部、緬甸等地，其中碳水化合物占63%，膳食纖維占16%，是淀粉的重要來源。綠豆淀粉因其高直鏈淀粉含量和高交聯特性，可用于生產具有多種益生作用的抗性淀粉（resistant starch，RS）。RS在小腸中不消化，但是可以在大腸中發酵和吸收，對于調節血糖水平，改善糖脂吸收和促進腸道有益菌增值方面有著重要作用。RS分為5 種類型，其中化學改性淀粉被歸類為RS4。RS4抗消化能力與取代基引起的消化酶攻擊空間受阻有關，取代基的引入導致更大的立體位阻效應，阻止了酶-底物復合物的形成，使其具有抗降解性，如醚化、交聯和酯化。目前檸檬酸酯化淀粉的制備方法主要為干熱法、濕熱法和電位循環法。當淀粉和檸檬酸混合體系受熱時，酸攻擊淀粉鏈，檸檬酸酐將淀粉鏈上的羥基取代。干熱酯化法是被用于生產改良淀粉制劑、食品工業、制藥等最常用的方法。添加其他化學成分的食品安全性難以控制，檸檬酸作為較安全的食品添加劑是近年來應用最廣泛且安全的制備RS4的物質之一。

硒是動植物生長發育必需的微量元素，不能自身合成，只能從食品和硒補充劑中獲得。硒在自然界中的存在形式可根據硒的形態分為有機硒和無機硒。與無機硒相比，有機硒更容易被人體吸收。硒多糖因其穩定性強、生物活性高被廣泛應用于硒補劑中。由于天然硒多糖中硒含量較低，因此需要通過硒化獲得硒含量豐富的有機硒多糖。硒多糖組成分為單聚糖和雜聚糖兩類，主要連接方式為1-3糖苷鍵，絕大多數為-構型。硒化修飾是通過NaSeO與半縮醛羥基（C-OH）和酯基發生反應形成，利用糖鏈上的羥基、氨基等活性基團與硒化試劑中的含硒化合物通過共價鍵結合在糖鏈上，檸檬酸酯化淀粉因具有較多的半縮醛羥基和酯基可作為硒化的主要原料。有研究表明，平菇、苦瓜、龍骨等植物硒化多糖有顯著降糖作用，可能是由于它們具有對-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制活性。王峙力等將甜玉米芯多糖進行硒化后發現對兩種酶的抑制作用顯著升高。同時，硒是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成部分，能促進受損胰島細胞修復及葡萄糖代謝降低血糖水平，Lian Kexun等通過研究硒化甘草多糖體內抗氧化活性，發現血液和肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性顯著升高，肝腎中丙二醛的含量顯著降低。RS4也可通過抑制與糖代謝有關酶活抵抗糖類消化，二者協同改善體內糖代謝情況。本研究以RS4為原料進行硒化，在抵抗消化的基礎上增強對酶的抑制作用，同時硒的引入可以增強抗氧化活性，修復受損的胰島細胞，進一步強化其生物學功能。硒化綠豆RS4（selenized mung bean resistant starch，MB-RS4·Se（IV））可作為抗氧化劑和酶抑制劑，研究其可能在體內發揮的作用，為尋找新型、高效、低毒的輔助降糖補硒食品及藥物提供初步實驗依據。

本實驗以綠豆抗性淀粉（mung bean resistant starch，MB-RS4）為原料，采用硝酸-亞硒酸鈉法制備MB-RS4·Se（IV），并對硒化前后MB-RS4采用掃描電鏡、紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射、凝膠滲透色譜、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）測定顆粒形貌、相對分子質量及結構變化；考察體外對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制作用并進行酶促反應動力學分析，為硒化綠豆抗性淀粉在功能性食品和天然藥物的開發領域提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆淀粉（食品級） 市售。

亞硒酸鈉 天津市大茂化學試劑廠；-葡萄糖苷酶（水解酶類，酶活力40～80 U/mg）、豬胰-淀粉酶（水解酶類，酶活力50 U/mg） 美國Sigma-Aldrich公司；4-硝基苯基---吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl--glucopyranoside，pNPG） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；可溶性淀粉 北京北化精細化學品有限公司；所有無機試劑均為分析純，購自天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

DGA-9080A電熱恒溫鼓風干燥箱 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；真空冷凍干燥機 基因有限公司；透析袋（m為1 000 Da） 上海源葉生物科技有限公司；S-570掃描電子顯微鏡 日本日立公司；D/MAX2000V型X射線衍射儀 日本理學制造公司；T6系列紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；4500傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；GPC-20A高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，GPC）儀、RID-20示差折光檢測器 日本島津公司；AVANCE III 600M NMR儀 德國布魯克公司；SPECTROstar Nano酶標儀 德國BMG LABTECH公司。

1.3 方法

1.3.1 MB-RS4的制備

根據李蒙娜的方法并作適當修改。將淀粉與檸檬酸按照干基比5∶2混合，加入適量蒸餾水攪拌均勻，用氫氧化鈉調節混合體系pH 3.5左右，室溫靜置12 h，于40 ℃烘干。取出干燥樣品粉碎過60 目篩，取篩下物于150 ℃酯化4 h，反應產物用無水乙醇洗滌3 次，37 ℃烘干至水分質量分數為8%，即得MB-RS4（RS4質量分數為83.72%）。

MB-RS4測定方法：準確稱取1 g樣品，加入5 mL-淀粉酶和葡萄糖苷酶混合液后，取不同時間的水解液采用GOPOD法進行測定。

根據下式計算樣品中RS4含量：

式中：和分別為淀粉酶水解反應20 min和120 min后產生的葡萄糖含量；TS為樣品中的總淀粉含量/mg；0.9為換算系數。

1.3.2 MB-RS4·Se（IV）的制備

根據王麗波等的方法并作適當修改。用50 mL體積分數為0.5%的HNO溶液溶解樣品（1.0 g），在室溫下攪拌30 min，加入1.0 g NaSeO和0.7 g BaCl，將混合物在66 ℃攪拌反應3.5 h。冷卻至室溫滴加1 mol/L NaOH溶液調節pH值至7～8。加入0.5 g NaSO除去溶液中的雜質Ba，4 000 r/min離心15 min，取上清液后透析出反應產生的無機鹽和多余的NaSeO、濃縮、醇沉，凍干即得MB-RS4·Se（IV），得率為26.450 6%。

1.3.3 MB-RS4·Se（IV）得率計算

按式（4）計算MB-RS4·Se（IV）得率：

式中：為MB-RS4·Se（IV）的質量/g；為MB-RS4的質量/g。

1.3.4 MB-RS4·Se（IV）中硒含量的測定

1.3.4.1 硒標準曲線的繪制

根據國標選用分光光度法測MB-RS4·Se（IV）中硒含量。測得硒標準曲線方程為=19.380 21-0.042 04，=0.995 7，其中：為硒含量/mg，為吸光度。

1.3.4.2 MB-RS4·Se（IV）中硒含量的測定

在酸性條件下MB-RS4·Se（IV）中Se可以與鄰苯二胺生成絡合物，絡合物在330～340 nm處有紫外吸收特征峰，根據此原理測得MB-RS4·Se（IV）中的硒含量。

5 mg樣品中加入2 mL HNO溶液（質量分數3%），4 ℃放置過夜。將樣品加熱至燒杯中無橙黃色煙霧生成，冷卻至室溫加入6 mol/L的鹽酸8 mL繼續加熱至無白色煙霧生成，轉移至25 mL容量瓶，加入2 mL鄰苯二胺（質量分數2%）溶液，然后用HCl溶液定容并調節pH 2，避光反應1 h，最后用5 mL甲苯萃取，在334 nm波長處測定有機相吸光度，按下式計算樣品中硒含量：

式中：為有機相中硒的質量濃度/（mg/mL）；為定容后待測溶液體積（25 mL）；為有機相總體積（5 mL）；為待測溶液體積（2 mL）；為MBRS4·Se（IV）質量（5 mg）。

本實驗制備所得MB-RS4·Se（IV）中硒含量為2.21 mg/g。

1.3.5 MB-RS4·Se（IV）的結構測定

1.3.5.1 掃描電子顯微鏡觀察

根據Asad等的方法并作適當修改對樣品的形貌和微觀結構進行研究。將樣品置于雙面膠帶噴金，于50.0 kV收集圖像。

1.3.5.2 紫外光譜測定

配制質量濃度為2 mg/mL樣品溶液，蒸餾水作空白對照，注射器吸取待測樣品，針孔過濾器過濾，190～400 nm波長范圍內掃描，掃描間隔1 nm。

1.3.5.3 傅里葉變換紅外光譜測定

根據Castrocampos等的方法并作適當修改對兩種物質進行分析，將2 mg樣品與200 mg溴化鉀（KBr）粉末混合并壓片于4 000～400 cm測定。

1.3.5.4 X射線衍射圖譜分析

根據González等的方法并作適當修改。將干燥細膩的樣品均勻分散于板框內壓實，使得樣品表面光滑平整，將樣品框固定后測試。衍射測試條件：管電流40 mA、管電壓40 kV、Cu靶波長1.540 6 ?、Co靶波長1.790 26 ?、掃描速率7°/min、2測量范圍5°～70°。

1.3.5.5 GPC法測定相對分子質量及分布

采用窄分布聚乙二醇（polyethylene glycol，PEO）作標準曲線相對校正法。標準樣品：窄分布PEO標樣組；RID-20示差折光檢測器；樣品處理：取50 mg樣品，加1 mL 90%二甲基亞砜溶液，溶解過夜，加2.5 mL無水乙醇，離心去除上清液，沉淀經無水乙醇洗滌2 次，風干后加入（0.1 mol/L NaNO+0.06% NaN溶液）溶解，于121 ℃反應20 min，5 000 r/min離心10 min，取20 μL上樣檢測；流速：0.6 mL/min，柱溫：35 ℃。

采用TSKgel GMPWXL凝膠色譜柱分別對改性前后MB-RS4相對分子質量的測定。樣品數據采用日本島津HW-2000 GPC色譜工作站分析計算。

1.3.5.6 NMR測定

根據Li Min等的方法并作適當修改，將樣品溶于DO，充分振蕩使其完全溶解，D-NMR（H-NMR、C-NMR）。

1.3.6 MB-RS4·Se（IV）體外酶活抑制測定

根據Wang Hao等的方法并作適當修改。將-葡萄糖苷酶用0.1 mol/L（pH 6.8）磷酸鹽緩沖溶液稀釋成1 U/mL，配制pNPG濃度為5 mmol/L。測定時，向96 孔板加入50 μL樣品溶液，同時加入50 μL pNPG溶液，37 ℃孵育10 min，取出加入100 μL-葡萄糖苷酶溶液37 ℃孵育45 min，加入50 μL濃度為0.2 mol/L的NaCO溶液終止反應，酶標儀測定405 nm波長處吸光度（）。反應體系見表1，以阿卡波糖作為陽性對照，酶活抑制率計算按式（6）計算：

表1 α-葡萄糖苷酶抑制作用反應體系Table 1 Composition of reaction system for α-glucosidase inhibition μL

式中：為添加樣品和酶時測定抑制組吸光度；為將酶液換為等體積緩沖溶液的對照組吸光度；為將樣品替換為等體積ddHO的背景組吸光度；為將樣品以等體積ddHO替代，酶液以緩沖溶液替代測定空白組吸光度。

1.3.6.2 抑制-葡萄糖苷酶動力學分析

固定酶濃度為1 U/mL，96 孔板中加入50 μL不同濃度樣品溶液，同時加入50 μL不同濃度pNPG溶液，在37 ℃孵育10 min，取出加入100 μL-葡萄糖苷酶溶液37 ℃孵育45 min，加入50 μL濃度為0.2 mol/L的NaCO溶液終止反應，酶標儀測定405 nm吸光度。最大酶促反應速率（）、米氏常數（）等動力學參數可通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖確定，即酶反應速率（）的倒數1/與底物濃度（pNPG）的倒數1/[]的關系圖。

1.3.6.3 對-淀粉酶的抑制作用

根據Sangilimuthu等的方法并作適當修改。用緩沖溶液配制濃度為2 U/mL的豬胰-淀粉酶和1%的可溶性淀粉，將不同濃度梯度的樣品溶液40 μL與-淀粉酶40 μL混合37 ℃孵育30 min，加入40 μL可溶性淀粉后繼續孵育10 min，然后加入160 μL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）保溫5 min煮沸顯色，稀釋2 倍體積后取200 μL于96 孔板，在540 nm測定抑制組吸光度，同時做對照組、背景組和空白組，通過式（3）計算抑制率，體系內所加溶液體積如表2所示。

表2 α-淀粉酶抑制作用反應體系Table 2 Composition of reaction system for α-amylase inhibition μL

1.3.6.4 抑制-淀粉酶動力學分析

將黨員后備培養、黨員教育管理、村級事務管理等納入對黨組織書記考核，強化督導檢查，對出現的問題及時診斷、及時對癥下藥。同時加強對基層黨組織書記干事創業的考核，將致富帶富能力當做重要考核指標。

根據曾傲瓊的方法并作適當修改。固定酶濃度為2 U/mL，40 μL不同濃度樣品溶液中加入40 μL-淀粉酶混勻，于37 ℃孵育30 min，取出加入不同濃度可溶性淀粉40 μL，于37 ℃孵育10 min，加入160 μL DNS保溫5 min煮沸顯色，稀釋2 倍體積取200 μL于96 孔板，在540 nm波長處測定吸光度。最大酶促反應速度（）、米氏常數（）等動力學參數可通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖確定，即酶反應速率（）的倒數1/與底物濃度（pNPG）的倒數1/[]的關系圖。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）表觀及結構分析

2.1.1 掃描電鏡分析

在相同放大倍數下，由圖1a、b可知，用檸檬酸處理淀粉后，酯化淀粉顆粒呈團塊狀，表面有局部腐蝕、裂縫和小的重疊層，這些可能是由酯化反應引起的，與高粱淀粉中用酸處理報道結果一致。在檸檬酸淀粉顆粒樣品中能夠看到環形顆粒狀，是因為在酸溶液中顆粒腫脹，然后在淀粉芯有組織區域塌陷并可能與檸檬酸作用有關，導致顆粒形態改變。圖中框內為由于檸檬酸作用淀粉顆粒之間的交聯處。而圖1c、d中MBRS4·Se（IV）淀粉顆粒完全塌陷并形成各種不規則形式碎片化，框內淀粉顆粒破碎并且表面粗糙呈多孔的蜂窩狀，這與Gu Yangeng等研究一致，由于硒化反應過程中HNO與亞硒酸鈉反應生成HSeO，HSeO電離產生Se與MB-RS4發生反應，改變了范德華力和分子間相互作用，造成顆粒破碎，分子質量變小。

圖1 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

2.1.2 紫外光譜分析

如圖2所示，NaSeO在225 nm有一個強的特征吸收峰，通過檸檬酸處理綠豆淀粉得到MB-RS4，然后再對MB-RS4進行硒化處理得到MB-RS4·Se（IV）。在紫外吸收光譜（190～400 nm）發生明顯改變，MB-RS4最大吸收峰所對應波長為220 nm，最大吸光度為0.677，并在272 nm處產生肩峰，為酯化反應產生的酯基發生電子躍遷造成。MB-RS4·Se（IV）紫外掃描最大吸收峰對應波長=248 nm，最大吸光度為1.223，明顯不同于MB-RS4和NaSeO，但呈現相似峰形，Se與MB-RS4發生相互作用導致結構發生變化，Se核外有空軌道，可接受MB-RS4酯基的孤對電子形成配位鍵，影響C＝O的電子躍遷，同時Se的d軌道電子受到配位體的影響發生躍遷，導致紅移和增色效應。

圖2 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）紫外光譜圖Fig.2 UV spectra of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

2.1.3 傅里葉變換紅外光譜分析

由圖3可知，在3 438.15 cm和2 932.45 cm處為O—H的伸縮振動峰和亞甲基的C—H伸縮振動峰，是典型的糖類物質的伸縮振動峰。1 000～1 200 cm處為C—O—C和C—O—H的特征峰，說明兩種樣品中有吡喃糖苷的存在。MB-RS4在1 745.23 cm和1 644.21 cm處分別為C＝O和—CO—的伸縮振動特征峰，說明MB-RS4中存在酯化糖醛酸，1 000～800 cm波數范圍內的峰為樣品中的和-構型。

圖3 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

MB-RS4·Se（IV）在1 745.23 cm處特征峰發生紅移，說明酯化糖醛酸參與了硒化反應。1 000～800 cm波數范圍內的峰在硒化后峰減少，說明構型發生了變化。MB-RS4·Se（IV）在787.88、730.88、654.75 cm處出現新振動峰。787.88 cm處為Se＝O伸縮拉伸振動峰，說明反應體系中亞硒酸與酯基發生取代反應。730.88 cm為C—C(Se)伸縮振動峰，是由于在反應過程中糖環發生斷裂形成不飽和鍵，游離Se在C＝C上發生順式取代造成。654.75 cm為Se—O—C的伸縮振動峰，是由于亞硒酸與C6上的羥基發生脫水反應形成。

2.1.4 X射線衍射圖譜分析

李良玉、Kaur等研究發現綠豆淀粉X射線衍射圖呈現C型結晶尖峰特征，結晶度較高。從圖4可以看出，MB-RS4的結晶結構被破壞，趨于一條彌散曲線，直觀看結晶度不高，2在18.38°左右，為V型結晶峰。說明檸檬酸處理后的MB-RS4淀粉顆粒輕度破壞，仍然存在部分結晶區；但是在MB-RS4·Se（IV）的衍射圖中發現，MB-RS4·Se（IV）曲線呈現彌散狀態，結晶結構被完全破壞，這與掃描電鏡結果一致。

圖4 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）X射線衍射圖Fig.4 X-ray diffraction patterns of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

2.1.5 分子質量及分布

由圖5可以看出，MB-RS4中出現2 個組分峰，MBRS4·Se（IV）中只有1 個組分峰（17 min后為容器或溶劑中的小分子雜質峰，故17 min后出現的峰不做分析）。在MB-RS4的圖譜中可以看出第1個峰出現的保留時間在7.643 min，峰面積占比48.49%，分子質量為6.8×10Da；第2個峰出現的保留時間在16.403 min，峰面積占比33.74%，分子質量為4.869×10Da。從圖5B可以看出，峰出現的保留時間在16.090 min，峰面積占比24.61%，分子質量為8.012×10Da；由圖5可以看出，MB-RS4中6.8×10Da分子質量占比較大，而MBRS4·Se（IV）則是以8.012×10Da分子質量占比較大。Tan等利用凝膠色譜對綠豆淀粉分子質量進行測定，測定結果表示綠豆淀粉分子質量的分布范圍在1.82×10Da和1.54×10Da之間。經由檸檬酸處理的綠豆淀粉發生酯化和脫水反應，將兩個或兩個以上的淀粉分子聚合，呈現穩定的多維空間網狀結構，聚合后形成大分子的MB-RS4，分子質量顯著增加。而在硒化過程中由于添加的硝酸和生成的亞硒酸又作用于MB-RS4，使MB-RS4分子鏈發生斷裂，導致硒化后分子質量顯著降低。

圖5 MB-RS4（A）、MB-RS4·Se（IV）（B）凝膠滲透色譜圖Fig.5 Gel permeation chromatograms of MB-RS4 (B) and MB-RS4·Se (IV) (B)

由圖6 可以看出，M B-RS4 中存在獨立的兩個組分，分子質量分別在3.91×10～1.26×10Da和3.62×10～0.29×10Da的范圍內。大分子質量段先出峰，小分子質量段后出峰，其中大分子質量物質在兩種組分中占比較大，且呈現正態分布，而小分子質量組分則呈現偏正態分布；MB-RS4·Se（IV）中只存在一個組分，分子質量分布在9.04×10～0.2×10Da范圍內，為小分子質量組分，硒化后的小分子質量段呈現正態分布，分布較均勻。MB-RS4中存在大量的酯化、交聯后形成的大分子物質，所以MB-RS4中大分子質量段所占比例較大。而在MB-RS4·Se（IV）中由于發生了硒化反應，反應過程中酯基和糖苷鍵的斷裂導致大分子質量組分轉化為小分子質量組分，致使小分子質量段比例增加。

圖6 MB-RS4與MB-RS4·Se（IV）相對分子質量分析圖Fig.6 Relative molecular mass analysis of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

從表3 可以看出，MB-RS4 的數均分子質量m=2.26×10Da，重均分子質量m=1.88×10Da，分散系數為8.3×10；MB-RS4·Se（IV）的m=1.3×10Da，m=1.20×10Da，分散系數為9.22。由以上可以看出，MB-RS4的分散系數較大，分子質量分布范圍較廣，而硒化改性后分散系數顯著降低，說明改性后體系更加均一，組成更簡單。

表3 MB-RS4與MB-RS4·Se（IV）相對分子質量測定結果Table 3 Relative molecular mass of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV)

2.1.6 NMR分析

MB-RS4·Se（IV）、MB-RS4 1H-NMR譜圖見圖7。圖8中顯示化學位移出現在4.98和1.35，一般情況下，化學位移大于5.00表現為糖類化合物的構型，化學位移小于5.00表現為糖類化合物的-構型。MB-RS4的異頭氫化學位移出現在4.98，說明MB-RS4為-構型。C譜中，MB-RS4位于61.45處的信號峰歸屬于糖環中的C6信號峰，72.66處的信號峰歸屬于C2、C3，位于82.09處信號峰屬于C4的信號峰，C4的強度與V型結構相關。MB-RS4中82.09中峰強度較大，說明MB-RS4主要以V型晶譜存在。同時，MB-RS4中102.00處出現一個單峰，可能來自相同范圍信號強度的V型復合物的信號峰，這些現象共同驗證了MB-RS4的X射線衍射圖譜中18.38°處的峰為V型結晶峰。173.65處信號峰為MBRS4中檸檬酸酐與淀粉共振的碳酯峰。

圖7 MB-RS4·Se（IV）、MB-RS4 1H-NMR譜圖Fig.7 1H-NMR spectra of MB-RS4·Se (IV) and MB-RS4

圖8 MB-RS4·Se（IV）、MB-RS4 13C-NMR譜圖Fig.8 13C-NMR spectra of MB-RS4·Se (IV) and MB-RS4

硒化改性后NMR氫譜中MB-RS4·Se（IV）的異頭氫化學位移出現在5.01，硒化后化學位移大于5.00，說明硒化導致構型轉變為構型。C譜中，180.59處為糖醛酸的典型信號峰。位于102.00處C1峰發生裂分出現104.24信號峰，可能是由于糖環在C1處由于Se的取代造成裂分并出現-異位形式的典型信號峰，硒化過程中1-4糖苷鍵斷裂可能是造成糖環上C1羥基發生翻轉造成構型改變的主要原因，位于82.09處C4的信號峰消失也驗證了MB-RS4·Se（IV）中1,4-糖苷鍵發生斷裂，1,4-糖苷鍵斷裂后造成V型結晶區消失。NMR氫譜和碳譜中均表現出構型翻轉與V型結晶區消失現象與紅外譜圖和X射線衍射圖譜一致。位于MB-RS4·Se（IV）中C2/C3化學位移未發生較大改變和裂分，說明反應未發生在糖環的C2和C3。MB-RS4·Se（IV）中C6信號峰位移至70.93處，說明在C6位處發生了取代反應，直接驗證了紅外光譜中亞硒酸與C6上的羥基反應生成Se—O—C，Yuan Bo、Lee等研究發現，硒化多糖位于62.93和62.41的C6均發生了硒化取代，與本研究結果一致。

2.2 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）體外酶活抑制及動力學分析

2.2.1 對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制作用

-淀粉酶抑制劑和-葡萄糖苷酶抑制劑可以有效降低小腸內葡萄糖或果糖釋放速率，從而延緩餐后血糖快速升高。圖9為MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制作用曲線，以阿卡波糖為陽性對照。MB-RS4對-葡萄糖苷酶抑制作用隨質量濃度增加呈現負抑制率，不表現抑制作用。但對-淀粉酶具有顯著的抑制活性，低于MB-RS4·Se（IV）和陽性對照阿卡波糖。其中MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）的IC值分別為4.992 mg/mL和2.684 mg/mL。隨著質量濃度升高，MBRS4·Se（IV）對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制作用升高后穩定，且呈現劑量依賴。硒化后的MB-RS4在同等濃度下對-葡萄糖苷酶表現顯著抑制活性。以上數據表明，硒化改性使得對-葡萄糖苷酶無抑制作用的MB-RS4具有-葡萄糖苷酶抑制作用，同時MB-RS4·Se（IV）對-淀粉酶的抑制作用明顯高于MB-RS4。MB-RS4·Se（IV）對-葡萄糖苷酶表現為抑制作用可能由于MB-RS4·Se（IV）中硒元素的引入。MB-RS4·Se（IV）對-淀粉酶抑制作用升高可能與MB-RS4·Se（IV）分子質量的降低有關，分子質量降低利于與酶的活性位點結合，導致抑制作用升高，這與MB-RS4·Se（IV）分子質量降低吻合。因此，需要通過抑制動力學分析研究其對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制類型。

圖9 MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）對α-葡萄糖苷酶（a）和α-淀粉酶（b）的抑制作用Fig.9 Inhibitory effect of MB-RS4 and MB-RS4·Se (IV) on α-glucosidase (a) and α-amylase (b)

2.2.2 對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶抑制動力學分析

根據Lineweaver-Burk曲線分析MB-RS4和MBRS4·Se（IV）對-葡萄糖苷酶和-淀粉酶的抑制類型。從圖10a中MB-RS4·Se（IV）對-葡萄糖苷酶的酶促反應速率與不同質量濃度底物的雙倒數圖可知，隨著MBRS4·Se（IV）質量濃度的增加，逐漸增大，逐漸減小，各質量濃度MB-RS4·Se（IV）的酶促反應速率擬合直線相交于第2象限。以上現象說明MB-RS4·Se（IV）對-葡萄糖苷酶為競爭抑制，MB-RS4·Se（IV）既可以通過與游離的-葡萄糖苷酶結合，也可通過與酶-底物復合物結合影響酶促反應的進行。圖10b、c為MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）對-淀粉酶的速率與底物質量濃度的雙倒數圖，隨著MB-RS4和MBRS4·Se（IV）濃度的增加，逐漸減小，也隨之減小，各濃度MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）的酶促反應速率擬合直線相交于第3象限。說明MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）對-淀粉酶為混合型反競爭性抑制，MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）只能通過與酶-底物復合物的結合抑制酶促反應。

圖10 MB-RS4·Se（IV）抑制α-葡萄糖苷酶（a）、MB-RS4抑制α-淀粉酶（b）、MB-RS4·Se（IV）抑制α-淀粉酶（c）的Lineweaver-Burk曲線圖Fig.10 Lineweaver-Burk plots for α-glucosidase inhibition by MB-RS4·Se(IV) (a),and α-amylase inhibition by MB-RS4 (b) and MB-RS4·Se (IV) (c)

通過對比上圖截距所反映的隨樣品質量濃度增加程度與抑制曲線發現，各質量濃度間截距的增長幅度與抑制曲線增長趨勢基本吻合。同時由擬合的斜率與截距和各質量濃度MB-RS4、MB-RS4·Se（IV）的線性相關圖發現其具有良好的線性關系，以上現象說明，MB-RS4和MB-RS4·Se（IV）結合在-葡萄糖苷酶、-淀粉酶和酶-底物復合物的單一抑制位點或單一類型的抑制位點上。

3 結論

對MB-RS4·Se（IV）結構進行表征及并研究其酶活抑制動力學，實驗表明：MB-RS4·Se（IV）呈碎片化，表面粗糙，顆粒變小，出現Se＝O、C—C(Se)、Se—O—C等官能團，紫外特征峰出現紅移和增色效應，結晶結構完全消失，相對分子質量大幅度減小，NMR顯示MBRS4·Se（IV）構型翻轉并在C6上發生了取代反應。MB-RS4·Se（IV）對-葡萄糖苷酶表現抑制作用，對-淀粉酶抑制作用顯著增加。通過酶促反應動力學實驗分析得到MB-RS4·Se（IV）對-葡萄糖苷酶的抑制類型為競爭性抑制，對-淀粉酶的抑制類型為混合型反競爭性抑制。MB-RS4·Se（IV）可添加在降糖藥物和功能性食品中，為減緩血糖升高協同微量元素強化提供新方向。