犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細胞增殖、遷移及相關基因表達的影響

林昊燁，陳淑儀，徐 麟，李 暄，王丙云，陳志勝，劉璨穎，陳勝鋒

（佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528200）

脊髓損傷（SCI）是一種中樞神經系統疾病，常發生于寵物身上，可能引發截癱、大小便失禁等［1］。髓鞘的完整性對于維持神經元功能至關重要，而SCI 時脊髓軸突發生急性脫髓鞘甚至神經纖維斷裂是導致神經功能缺失的重要原因。盡管神經纖維很難再生，但髓鞘可促進軸突末梢的延長以及重建突觸聯系，因此在SCI治療中，促進髓鞘的修復進而促進神經功能的改善是SCI治療的重要環節［2-3］。

犬脂肪間充質干細胞（ADMSCs）具有較強分化能力，能分泌多種細胞因子和炎性趨化因子［4］。研究表明，間充質干細胞（MSC）分離于犬的皮下脂肪組織，具有自我更新潛力，可顯著增加脊髓組織髓鞘含量，但機制尚不清楚。髓鞘由膠質細胞和施萬細胞組成，且有證據顯示SCI 時施萬細胞參與髓鞘的修復［5-6］。因此，本試驗以RSC96細胞（一種大鼠施萬細胞的細胞系）為對象，模擬SCI 時脊髓組織低氧缺糖的微環境，制備低氧缺糖RSC96 細胞模型，通過離體試驗研究ADMSCs 對低氧缺糖RSC96 細胞增殖、遷移及相關基因表達的影響，旨在探究MSC 促進髓鞘修復的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 RSC96細胞株（來源于大鼠施萬細胞的細胞系）購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 主要試劑及耗材 CCK-8 試劑盒，RNA 提取及反轉錄試劑盒，TB Green PCR Master Mix，96孔qPCR反應試劑盒及qPCR封板膜；6孔及24孔Transwell 共培養板；細胞劃痕插件（500 μm 劃痕區域）。

1.3 主要儀器 CO2培養箱；低氧培養箱；正置熒光顯微鏡；離心機；熒光定量PCR 儀（LightCycler480）。

1.4 方法

1.4.1 RSC96 細胞培養 取出凍存RSC96 細胞，37 ℃水浴速溶，1 000 r∕min 離心5 min，棄去凍存液，加入培養基重懸細胞，以1×106cell 密度接種于培養皿。在37℃5% CO2培養箱中培養，2～3d換液，取P3代細胞做后續實驗。

1.4.2 犬ADMSCs 培養 本實驗室已建立犬ADMSCs 原代細胞的分離及鑒定方法，取出凍存的3～6 代犬ADMSCs 細胞，37 ℃水浴鍋速溶，1000r∕min離心5 min，棄去凍存液，加入培養基，以1×106cell的密度接種于培養皿。在37 ℃5% CO2培養箱中培養，2～3 d 換液，取P3 代細胞做后續實驗。

1.4.3 RSC96 細胞低氧缺糖模型的建立 取對數生長期RSC96細胞以1×105cell∕孔分別接種到5個24 孔板中，每板設置6 個復孔。其中1 板作為空白對照組常規培養，另4 板作不同造模時長的低氧缺糖模型組細胞板，待細胞長至60%～70%，棄去完全培養基，PBS 洗滌1～2 次，除去多余完全培養基。每孔加入1 mL DMEM 無糖培養基，在37 ℃3% O2和5% CO2低氧培養箱中分別培養造模6、8、10、12 h，用CCK-8 分別檢測5 板細胞活性及鏡下觀察細胞形態。5板細胞皆棄去舊液，每孔加入含10%CCK-8 的DMEM 200 μL，37 ℃暗室孵育30 min，隨后轉移到96 孔板，測定OD 值。低氧缺糖模型組細胞增殖抑制率為50%左右，代表模型建立成功。細胞增殖抑制率＝（空白對照組-低氧缺糖模型組）∕空白對照組×100%。

1.4.4 犬ADMSCs 對低氧缺糖模型RSC96 細胞增殖的影響 設空白對照組、模型對照組、MSC共培養組及空白培養基組，空白對照組為常規培養的處于對數生長期的RSC96 細胞，其余三組為制備的低氧缺糖模型RSC96 細胞，造模時間為10 h。造模后模型對照組添加RSC96 完全培養基1 mL；MSC 共培養組復孔帶Transwell 小室，小室上層以1×105cell∕孔接種犬ADMSCs細胞并加入500 μL干細胞培養基，小室下層加入500 μL RSC96完全培養基；空白培養基組添加500 μL干細胞培養基及500 μL RSC96 完全培養基。24 h后使用CCK-8法檢測各組間OD值。

1.4.5 犬ADMSCs 對低氧缺糖模型RSC96 細胞遷移的影響 設置空白對照組、模型對照組、MSC 共培養組和空白培養基組，每組設置3 個復孔，每孔安裝1個細胞劃痕插件，保證插件緊貼培養板底，在插件兩室接種1×104cell∕孔，待細胞鋪滿后移除劃痕插件。3個實驗組按照前述方法進行共培養及細胞培養基調整，除空白對照組外3組均進行低氧缺糖造模。分別在造模后0、12、24 h 拍照并計算遷移率。遷移率＝（0 h 劃痕面積-目標時間段劃痕面積）∕0 h劃痕面積×100%。

1.4.6 犬ADMSCs 對低氧缺糖模型RSC96 細胞增殖遷移相關基因表達的影響 取對數生長期RSC96細胞以5×105cell的密度接種到6孔板，分3組且每組設3 個復孔，按照前述方法分組及處理。按照說明書提取各組細胞的RNA，在紫外分光光度計下檢測A260∕A280 數值，將所提取合格樣品的RNA 按照說明書方法反轉錄為cDNA，-30 ℃保存。

在NCBI Primer-blast得到NGF、NT-3、Nrg-1和GAPDH（內參）基因的PCR引物序列（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。配置qPCR 反應體系，運行qPCR 反應程序，得到各基因相應Ct 值后，采用相對定量法2-△△Ct計算各基因mRNA表達水平。

表1 PCR引物序列表

1.4.7 數據分析 使用ImageJ 計算細胞遷移面積大小；采用IBM SPSS Statistics 20統計軟件進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 為差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 RSC96 細胞形態學觀察 正常組RSC96 細胞貼壁生長，形態為不規則神經元狀，細胞折光性良好，生長速度較快。低氧缺糖造模后RSC96細胞貼壁生長，細胞折光性變差，細胞扁平偽足延長，細胞顆粒變性，生長速度減緩。

2.2 犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細胞增殖的影響 由圖1 可知，0 h 時空白對照組OD 值均顯著高于其余三組（P＜0.05）；24 h后MSC共培養組OD值顯著高于空白培養基組與模型對照組（P＜0.05）。

圖1 犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細胞增殖的影響

2.3 犬ADMSCs 對低氧缺糖模型RSC96 細胞遷移的影響 由表2 可知，0 h 時4 組間劃痕面積無顯著差異（P＞0.05）；12 h 時MSC 共培養組與空白對照組的劃痕面積顯著小于另外兩組（P＜0.05）；24 h時空白培養基組的劃痕面積顯著大于空白對照組（P＜0.05），空白培養基組的劃痕面積顯著小于模型對照組（P＜0.05）。

表2 犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細胞遷移的影響

2.4 犬ADMSCs對低氧缺糖模型RSC96細胞增殖、遷移相關基因表達的影響 如圖2所示，各處理組NGF 和NT-3的mRNA 表達水平，MSC共培養組顯著高于空白培養基組（P＜0.05），而與模型對照組的顯著性不差異（P＞0.05）。Nrg-1 的mRNA 表達水平，MSC 共培養組顯著高于其余三組（P＜0.05）。

圖2 各組間RSC96細胞增殖、遷移相關基因的mRNA表達水平

3 討論

本試驗結果表明，MSC 可促進低氧缺糖RSC96 細胞的增殖，提高細胞的遷移率和細胞增殖（NGF、NT-3）、遷移（Nrg-1）相關基因mRNA的表達量。提示MSC 治療SCI 可能通過增強SC 活性來促進損傷修復。

為揭示MSC 促進RSC96 細胞增殖及遷移的分子機制，本試驗檢測了NGF、NT-3、Nrg-1 等基因的表達水平。NGF 是一種神經營養因子，對神經元存活及促進軸突生長具有重要作用［7］。NT-3 基因可促進神經干細胞增殖，促進其他細胞向神經元的分化等。本試驗中NT-3基因表達量的增加可能有助于提升髓鞘含量和軸突再生，從而改善動物的運動功能。Nrg-1基因在SCI后，可以通過酪氨酸激酶受體信號傳導至OPC，部分OPC轉化為功能性SC，從而自發性修復脊柱功能性髓鞘［8］。

MSC是位于中胚層的一種未分化細胞，具有多分化潛能，大量研究表明，MSC對SCI的修復具有積極作用，但其機制目前尚存爭議。將MSC移植至受損脊髓組織后，可促進膠質細胞釋放神經營養因子和成纖維生長因子等，從而促進神經細胞修復［9］。

綜上所述，本次共培養離體試驗探究了MSC修復髓鞘損傷的分子機制，初步證明MSC對受損髓鞘的修復主要是通過改善損傷環境，促進施萬細胞的增殖和遷移來實現的。