LC-MS/MS測定青稞中氨基酸的含量及主成分分析

王猛強，邱 城，張唐偉，李騰飛，李 壯，王 淼，曹 振，王珊珊，鄭鷺飛，金茂俊，王 靜，邵 華，金 芬，佘永新*

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；3.西藏自治區農牧科學院農業質量標準與檢測研究所，西藏拉薩 850000)

青稞是我國青藏高原的主要糧食作物之一，非常適合種植在青海、西藏、四川、甘肅、云南等高海拔地區，特定的地理環境和氣候條件，賦予其獨特的營養成分，具有良好的經濟和食用價值。青稞中的氨基酸組成成分較為全面，不同地區、不同品種的青稞其氨基酸的含量差異較大,因此氨基酸的含量常作為評價青稞中營養價值重要的指標之一。目前青稞中氨基酸含量的檢測主要有氣相色譜法、液相色譜法、分光光度法、毛細管電泳法、化學發光法、近紅外光譜法、熒光光譜法等方法。張紅漫等利用氣相色譜串聯質譜技術，通過對水解液的衍生化，實現了對沙宛子中氨基酸的定量分析；劉百戰等采用毛細管氣相色譜法，通過氯甲酸乙酯衍生化，實現了對卷煙中游離態氨基酸的定量分析；張國華等采用液相色譜串聯質譜的方法，通過異硫氰酸苯酯(PITC)作為柱前衍生化試劑，實現了對蓮霧中15種游離氨基酸的定量檢測；孔祥虹等利用超高效液相色譜串聯質譜的方法，通過異硫氰酸苯酯(PITC)衍生法，實現了濃縮果汁中20種氨基酸的定性定量分析。這些檢測方法各有優缺點，有些方法其分析時間較長(在1 h以上)、檢測效率低，或者需要柱前、柱后衍生，檢測步驟較為煩瑣等。利用液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)檢測氨基酸可以解決檢測時間長、避免衍生化等問題，因此，建立青稞中氨基酸含量的液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)檢測方法具有重要現實意義。

主成分分析法(PCA)是目前常用的統計方法，是一種將多指標轉化為幾個不相關綜合指標的多元統計分析方法，其通過數據降維，排除眾多信息的相互重疊部分，能夠盡可能多地表征原數據特征而不丟失信息。該試驗通過建立高效液相色譜串聯質譜方法測定不同區域青稞中氨基酸的含量，并結合主成分分析，評價不同品種的青稞氨基酸的組成差異，為青稞品種的適應性和品質特性提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

青稞材料。來自5個產地的30個品種，具體材料信息如表1所示。

試劑。鹽酸，分析純，北京百匯佳興試劑公司；甲醇、乙腈、甲酸，色譜純，美國Fisher公司。標準品甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸(≥98%)，上海源葉生物有限公司。標準品丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸(≥99%)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

儀器。Agilent1200 液相色譜，美國Agilent公司；AB5000三重四級桿質譜，美國SCIEX公司；旋轉蒸發儀，日本 EYELA公司；電子天平，美國ScienTific Industries公司；真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

表1 青稞試驗材料品種及來源地

標準混合液的配制。適量稱取13種氨基酸化合物標準品，溶解在0.1 mol/L鹽酸水溶液中，配制成1.25 mmol/L的標準混合液，保存在-20 ℃冰箱中。

色譜條件。選擇3種不同的分離色譜柱進行分離，分別是XBridgeC(5 μm,2.1 mm×150 mm)、XBridgeHILIC(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)、UItimateHILIC Amphion Ⅱ (3 μm，2.1 mm×100 mm),利用分離結果選定較好的色譜柱。

流動相的優化，即采用水相流動相分別為0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、5 mmol/L甲酸銨水溶液，有機流動相選擇乙腈分別進行優化；進樣體積2 μL;流速0.3 mL/min，柱溫25 ℃。

質譜條件優化。該方法的質譜條件選擇帶有三重四極桿的質譜儀。檢測模式為多反應監測(MRM)。離子源溫度設定為450 ℃，碰撞氣(CAD)壓力設定68.95 kPa，氣簾氣(CUR)設為241.32 kPa，霧化氣(GS1)壓力設定為241.32 kPa；輔助加熱氣(GS2)壓力設定為206.84 kPa。并對各個氨基酸的前體離子、產物離子、掃描時間、碰撞電壓等進行了優化。氨基酸具體的質譜參數如表2所示。

樣品前處理。將青稞樣品進行超微粉碎，過55目篩子，用密封袋裝好備用，保存在-20 ℃的冰柜中。精密稱取0.1 g青稞粉碎后全粉樣品，精確到0.000 1 g，放入220 mL的玻璃消解管，再加入體積比為1+1的濃鹽酸10 mL，在渦旋儀上振蕩2 min，超聲10 min，進行氮吹除氧，迅速關上蓋子，放到110 ℃的真空干燥箱中進行加熱水解，取出水解液后，采用定量濾紙過濾。吸取1 mL進行氮吹(或烘干)，再用純水復溶，稀釋10倍后，過0.22 μm濾膜后上機檢測。

利用SPSS統計軟件進行主成分分析，采用Excel數據分析軟件進行數據整理與統計。

2 結果與分析

結合XBridgeC(5 μm，2.1 mm×150 mm)、XBridgeHILIC(3.5 μm，2.1 mm×150 mm)、UItimateHILIC Amphion Ⅱ(3 μm,2.1 mm×100 mm)這3個色譜柱，流動相A選擇0.1%甲酸水、0.2%甲酸水和5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B選擇乙腈，分別進行分離優化，結果發現C柱的分離效果較差，在1～3 min分離出色譜峰，色譜柱

表2 質譜參數

接下表

保留能力較差，流動相使用0.1%甲酸水，分離效果較好。最終選擇XBridgeHILIC(3.5 μm,2.1 mm×150 mm)色譜柱，流動相A是0.1%甲酸水，流動相B為乙腈，然后通過調試流動相洗脫程序，最終確定其梯度洗脫方法如表3所示，能夠較好地分離這13種氨基酸物質，其選擇離子色譜圖如圖1所示。

氨基酸的檢測分析主要在將樣品中的多肽和蛋白質樣品進行完全水解，使其游離出所有的氨基酸，參照國標方法進行前處理，確定了水解時間在12 h、水解溫度在110 ℃時，氨基酸的水解最為徹底。

表3 梯度洗脫程序

圖1 氨基酸選擇離子色譜圖Fig.1 Selected ion chromatogram of amino acids

取各個氨基酸的標準品，用0.1 mol/L鹽酸溶解，配制成5個濃度的標準品溶液，分別為1.25、2.50、5.00、12.50、65.00 nmol/mL。以標準品溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。13種氨基酸在1.25～65.00 nmol/mL具有良好的線性關系，其結果如表4所示。

表4 13種氨基酸的線性關系

稱取同一份樣品5次，依據“..”樣品前處理方法操作，在試驗條件下測定，結果發現(表5)，13種氨基酸的方法精密度的相對標準偏差(RSD)在3.05%～6.93%，表明該方法有較好的精密度。

表5 精密度試驗(n=5)

精密稱取0.1 g樣品9份，分別加入氨基酸混合標準溶液(濃度為1.25 mmol/mL)20、50、100 μL，結果表明(表6)，按試樣制備方法處理樣品中13種氨基酸的平均回收率在76.43%～101.39%，RSD≤12.12%。表明該方法有良好的準確度。

表6 加標回收率和相對標準偏差(n=3)

采用液相色譜串聯質譜法對30個青稞品種中氨基酸含量進行檢測，結果如表7所示，在13種氨基酸中谷氨酸含量最高，對這些青稞樣品中的氨基酸指標進行主成分分析，其結果見表8，主成分分析一共提取出特征根均大于1的5個主成分，其方差貢獻率分別是30.664%、18.933%、13.455%、8.809%、7.937%，累計方差貢獻率為79.798%。由表9可知，主成分1()在甘氨酸、絲氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸上有較多的載荷量，相關性較大，主成分2()在谷氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸的相關性較大，主成分3()在丙氨酸、酪氨酸的相關性較大，主成分4()在苯丙氨酸、亮氨酸的相關性較大，主成分5()在甘氨酸、蘇氨酸的相關性較大。

表7 30種青稞中氨基酸的含量

表8 青稞中氨基酸的特征根和方差貢獻率

根據提取的5個主成分的成分得分系數(表10)，利用其特征向量，得到其線性組合如下：

=0107+0076+0204-0011-0237+0001-0036+0209-0224-0002+0153+0131-0013

表9 主成分的載荷系數

=-0147+0284+0065+0257+0009-0062+0193+0046+0080+0274-0051+0103+0309

=-0167+0125+0129-0091+0037+0504+0362+0024+0051-0013+0210-0196-0176

=0263-0223-0000-0000+0097+0169-0343+0121+0187+0516+0385-0298+0215

=0550-0213+0148+0597+0074+0061+0277-0004+0135+0021-0145+0075-0334

式中，、、、、、、、、、、、、分別代表甘氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量。

綜合得分是方差貢獻率與成分得分乘積后累加計算可得，其模型為=0384+0237+0169+0110+0099。由此可以計算各個青稞樣品中的綜合得分，并進行排序來評價青稞的氨基酸品質。如表11所示，其中西藏品種的藏青2000、喜拉19、藏青16、藏青25、藏青148等綜合得分較高，排名靠前，表明這些青稞品種中氨基酸含量較高，具有很好的適應性。

表10 主成分的成分得分系數

3 結論

該研究建立了青稞中氨基酸含量的液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)檢測方法，具有快速便捷、準確度高、操作簡單等特點，可適用于青稞等谷物中的氨基酸含量分析。結合主成分分析，評價了不同地區青稞品種的氨基酸含量，結果表明，西藏地區的藏青2000、喜拉19、藏青16、藏青25、藏青148等品種在不同地區表現較好，其氨基酸含量較高，具有很好的適應性。

表11 不同品種青稞氨基酸的綜合得分和得分排序