半滑舌鰨養殖尾水處理系統中硝化細菌分離篩選及脫氮效果研究

馬 超，陳春秀，王 宇，劉 皓，于燕光，殷小亞，鄭德斌，賈 磊，王群山，周 勇

(天津市水產研究所，天津 300221)

水產養殖快速發展在創造漁業經濟的同時也產生了大量的含有有機物、含氮有害物質及抗生素等物質的養殖尾水，大量有害物質超標的水產養殖廢水直接排放會對周圍水生生態系統或近海生態系統造成顯著影響。近年來，開發高效的海產養殖廢水治理技術成為水產養殖的熱點問題，而養殖廢水中含氮元素的污染物是造成水體污染和富營養化的主要原因之一，因此如何去除養殖廢水中的含氮有害物質對海水養殖廢水排放及循環利用具有重要意義。為有效解決水產養殖尾水排放所引起的環境問題，目前各界學者通過研究開發出各種水產養殖廢水處理的技術，包括物理處理、化學處理和生物處理等技術，其中生物處理技術具有環保、經濟、高效等優點，在水產養殖尾水處理中應用廣泛。

氨氮主要來源于水產養殖動物的殘餌、排泄物、尸體等有機物，亞硝酸鹽氮則是氮元素在養殖水體循環中的一種中間產物，含有一定毒性，高濃度氨氮及亞硝酸鹽氮的養殖水體不僅嚴重危害水產動物的正常生長發育及導致病害頻發，還會對周邊生態環境造成惡劣的影響。而生物處理技術中主要是通過微生物調控來實現水產養殖尾水脫氮處理，目前生物脫氮技術已經成為該領域的研究熱點，國內外學者從環境中分離篩選出多種高效脫氮細菌，包括芽孢桿菌()、假單胞菌()、不動桿菌()、紅球菌()等細菌，因此篩選高效的脫氮細菌并應用到水產養殖尾水處理中，是調控養殖水體、保持循環養殖水體水質良好、實現綠色養殖的有效途徑。該研究通過對半滑舌鰨養殖尾水處理系統生物填料中細菌進行分離、篩選、鑒定，并對其在養殖尾水中脫氮效果進行初步研究，對提高海水養殖水體處理系統的脫氮效率具有指導作用。

1 材料與方法

該試驗菌株分離篩選自天津漢沽區半滑舌鰨工廠化養殖系統尾水處理中的生物填料。

取生物填料的水樣懸液10 mL，用無菌水稀釋制備成10的稀釋液，取0.1 mL涂布在異養硝化固體培養基上，在培養箱中28 ℃恒溫培養2～3 d，再挑取不同形態特點的菌落分離純化3次以上直到獲得單一的菌落為止。鏡檢驗純并采用甘油保存法-80 ℃保種。

將分離純化的菌株送往上海微基生物科技有限公司進行16S rDNA序列測序，所得結果與NCBI數據庫進行同源性比對，最后得出同源性最高的物種。

將分離純化的菌株分別接種至裝有100 mL異養硝化液體培養基的250 mL錐形瓶中富集培養，在培養箱中28 ℃、120 r/min培養24 h。再將富集后的菌懸液再次分別以1%的接種量接種至分別裝有異養硝化培養基的250 mL錐形瓶中，于培養箱中28 ℃、120 r/min培養24 h后，移取搖勻的10 mL菌液，用離心機8 000 r/min離心后取上清液，檢測其中氨氮濃度。測定方法參照海洋監測規范(GB 17378.7—2007)與《水和廢水監測分析方法》進行。根據氨氮去除率，初篩出高效的硝化細菌。

菌株形態學鑒定。將初篩的高效硝化細菌接種于固體培養基平板，在培養箱中28 ℃條件下培養24 h后在顯微鏡下觀察、記錄菌落特征。在平板上選取單菌落挑于涂片上固定并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察、拍照和記錄菌落形態特點，隨后對篩選菌株進行掃描電鏡觀察并拍攝照片。

初篩菌株對養殖尾水的脫氮效果初步研究。從半滑舌鰨工廠化養殖系統尾水處理池取養殖尾水，抽濾后，分裝到18個錐形瓶中，每瓶250 mL，向各水樣瓶中分別以1%的接種量接入2株篩選得到的菌株(每組3個平行)。接種后，將水樣置于28 ℃、120 r/min培養箱中培養24 h，24 h后取出水樣測定水體中氨氮、硝態氮、亞硝態氮的含量，測定方法參照海洋監測規范(GB 17378.7—2007)與《水和廢水監測分析方法》進行。

使用SPSS 20.0軟件對所有試驗數據進行單因素方差分析，試驗數據均以平均值±標準差表示。采用Excel軟件對試驗數據進行統計分析并作圖。

2 結果與分析

采集的生物濾池填料樣品經分離純化出7株形態大小不同的菌株，分別命名為WY1、WY3、WY4、WY5、WY6、WY8、WY10，將所測7株菌株的16S rDNA測序結果與GenBank數據庫中核酸序列進行比對，結果顯示，WY1、WY3、WY4、WY5、WY6、WY8、WY10分別與脫氮鮑曼氏菌()、麥氏交替單胞菌()、仙河鹽單胞菌()、杜氏硫桿菌()、黃醇假交替單胞菌()、紅色假交替單胞菌()和施氏假單胞菌()同源性最高，其初步鑒定結果見表1。

為進一步篩選出能夠高效進行硝化作用的菌株，對7株菌株進行了氨氮去除能力檢測，圖1為7株菌株在氨氮初始濃度為101 mg/L的異養硝化培養基中接種24 h后的氨氮去除率，結果表明，分離純化的7株菌株對氨氮均有一定的去除能力，其中WY10的氨氮去除率最高，為64.52%，其次為WY4的53.99%。因此，選擇WY4和WY10為目標菌株進行下一步研究。

表1 不同菌株的16S rDNA同源性比較

圖1 菌株在異養硝化培養基中培養24 h的氨氮去除率Fig.1 The NH4+-N removal rates of each strain in heterotrophic nitrification medium at 24 h

菌株形態及染色。WY4和WY10這2株菌株氨氮去除率效果較理想，對這2株細菌進行形態鑒定。將2株細菌在培養基平板上培養24 h后觀察菌落形態特征，主要形態學特點見表2。革蘭氏染色結果如圖2所示，2株菌株均為革蘭氏陰性菌。通過掃描電鏡結果(圖3)觀察到WY4菌株為球狀，WY10菌株為桿狀。

表2 菌株的菌落形態特征

高效硝化細菌對養殖尾水脫氮效果。開展對養殖尾水脫氮效果初步研究，將篩選出的2株菌(WY4、WY10)接種到養殖尾水中(氨氮濃度為0.819 mg/L，亞硝態氮濃度為0.571 mg/L，硝態氮濃度為0.193 mg/L，總氮濃度為1.857 mg/L)培養24 h，結果如圖4～5所示。從圖4～5可以看出，菌株處理養殖尾水24 h后，水體中氨氮、硝態氮和亞硝態氮濃度均出現明顯下降，WY4處理后水體中氨氮濃度為0.038 mg/L(去除率95.36%)，亞硝態氮濃度為0.002 mg/L(去除率99.65%)，硝態氮濃度為0.026 mg/L(去除率86.53%)，而菌株WY10處理養殖尾水24 h后，水體中的氨氮濃度為0.222 mg/L(去除率72.89%)，亞硝態氮濃度為0.032 mg/L(去除率94.40%)，硝態氮濃度為0.033 mg/L(去除率82.90%)，表明2株菌株均具有好氧反硝化作用，能夠顯著降低養殖水體中的硝態氮。

圖2 菌株WY4(a)和WY10(b)的革蘭氏染色Fig.2 Gram stain graph for strains WY4(a)and WY10(b)

圖3 菌株WY4(a)和WY10(b)的掃描電鏡Fig.3 The scanning electron micrograph of strains WY4(a)and WY10(b)

圖4 接入菌株24 h后養殖尾水的氨氮、硝態氮、亞硝化氮濃度變化Fig.4 Concentration changes of ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in aquaculture tail water 24 hours after inoculated strains

圖5 不同菌株在養殖尾水中對氨氮、硝態氮、亞硝化氮的去除率Fig.5 Removal rates of ammonia nitrogen，nitrate nitrogen and nitrous nitrogen by different strains in aquaculture tail water

3 討論

施氏假單胞菌()于1895年被Burri和Stutzer首次描述，近年來，越來越多的施氏假單胞菌菌株被從不同的環境中分離出來，如Su等從處理豬場廢水處理系統中、Rezaee等從石油化工廢水中都分離出施氏假單胞菌。此外有研究表明此細菌為異養硝化好氧反硝化細菌，此類細菌因以生長速度快、脫氮反應高效等優點被廣大研究人員關注并應用，Ji等將施氏假單胞菌接種在生物濾池的硝酸鹽廢水中，結果表明廢水中硝態氮去除率達到98.5%；張達娟等用從凡納濱對蝦養殖池塘中分離出來的施氏假單胞菌凈化模擬養殖水體，結果表明，氨氮、亞硝態氮、硝態氮去除率分別達到91.73%、97.39%、91.22%。該研究從半滑舌鰨養殖尾水處理系統中分離篩選出的施氏假單胞菌菌株WY10通過鑒定為一株異養硝化-好氧反硝化革蘭氏陰性菌，具有良好的氨氮去除效果，而且還有效降低了亞硝態氮和硝態氮的濃度，表現出良好的脫氮能力，施氏假單胞菌僅能以無機碳源為底物進行硝化-好氧反硝化脫氮，因此推斷其代謝途徑可能為完全硝化反硝化通路，與上述學者研究結果相似，但去除率有所差異，可能與菌株差異、培養溫度、接種量等條件有關。

鹽單胞菌()為中度嗜鹽革蘭氏陰性菌，大多數菌株適合在30 ℃和pH 7.2～7.5條件下生長，多數研究集中在鹽堿環境中的石油烴降解，只有少數幾株菌株的脫氮作用被報道，如孫雪梅等在網箱魚類養殖區沉積環境中分離出的鹽單胞菌X3和沈輝等在海洋灘涂沉積物中分離出的鹽單胞菌MD5，在高鹽環境下均具有較強的脫氮能力。該試驗中分離的菌株WY4，通過16S rDNA序列同源性分析與仙河鹽單胞菌()相似度最高，且生長特點符合鹽單胞菌，有較強的脫氮能力，同時研究表明鹽單胞菌菌株WY4具有異養硝化好氧反硝化細菌的特點，是一株具有潛力的海水養殖尾水凈化菌株。通過試驗發現，在處理養殖尾水時菌株WY4氨氮24 h去除率(95.36%)比初篩(53.99%)有所提高，王歡等研究表明細菌的異養硝化和反硝化作用是相互促進的，當硝化反硝化同時進行時，比單一作用的脫氮效率和菌體生長速度都有所提高。而該試驗中，初篩時的溶液中氮主要以氨氮形式存在，而養殖尾水中不僅含有氨氮，還有一定濃度的亞硝態氮和硝態氮，24 h各形態氮的濃度都有所減少，由此推斷菌株WY4在處理養殖尾水的同時發生了硝化和反硝化作用，從而提高了氨氮24 h去除率。

隨著我國水產養殖的高速發展，工廠化養殖密度逐漸加大，殘餌、糞便、養殖生物殘骸等含氮有機物質不斷積累，使得養殖尾水難以循環使用，加之環境資源保護意識不斷提升及各種環保政策的落實，也使得養殖尾水排放成為困擾養殖企業的重要問題。傳統的微生態制劑僅為光合細菌、乳酸菌和芽孢桿菌中的一種或多種，品種較為單一，且很少用于尾水處理，因此尋找具有綠色、環保同時能改善水質的菌株制成微生態制劑成為近年來水產養殖的熱點。眾多研究也表明從養殖尾水或池塘底泥中分離篩選的土著菌種脫氮效果更高。該研究從半滑舌鰨養殖尾水處理系統中分離篩選出的假單胞菌和鹽單胞菌是常見的脫氮細菌，對養殖尾水也具有較強的脫氮能力，因此，它們具有廣泛應用于工廠化養殖尾水處理的潛力，具有廣泛的市場應用前景。但對這2株土著硝化細菌的脫氮機理和性質還有待進一步研究，尤其是作為微生態制劑的工藝和組合方式還有待探究。

4 結論

從半滑舌鰨養殖尾水處理系統中分離純化出7株異養硝化細菌，對分離的菌株用16S rDNA序列分析進行了鑒定，7株菌株同源性最高的分別為脫氮鮑曼氏菌(WY1)、麥氏交替單胞菌(WY3)、仙河鹽單胞菌(WY4)、杜氏硫桿菌(WY5)、黃醇假交替單胞菌(WY6)、紅色假交替單胞菌(WY8)和施氏假單胞菌(WY10)。通過對7株菌株氨氮去除能力檢測得到高效硝化細菌WY4和WY10，氨氮去除率分別為53.99%和64.52%，并對其進行了形態學觀察和處理養殖尾水24 h脫氮效果的初步研究，結果表明WY10和WY4 這2株菌株均為革蘭氏陰性菌，在處理養殖尾水24 h后，WY4菌株氨氮、亞硝態氮、硝態氮去除率分別為95.36%、99.65%、86.53%，WY10菌株氨氮、亞硝態氮、硝態氮去除率分別為72.89%、94.40%、82.90%。因此該研究篩選出的2株異養硝化細菌均為異養硝化-好氧反硝化細菌，具有調控海水養殖尾水的潛在應用價值。