嬰幼兒配方粉中生物素提取方法與微生物法測定精密度的研究

劉旸, 劉九陽, 李原野, 王淼, 房玉國, 張麗宏, 黃曉林, 夏行昊, 齊會娟

（1.黑龍江省綠色食品科學研究院, 哈爾濱 150028；2.東北農業大學食品學院, 哈爾濱 150036；3.黑龍江惠豐乳品有限公司大慶分公司, 黑龍江 大慶 163000）

0 引言

生物素B7是一種無色或白色結晶粉末物質[1-6], 是水溶性B族維生素[7-10]。生物素在人體中主要以羧化酶輔酶[11-13]的形式參與細胞中脂肪、蛋白質以及糖類代謝等一切生命活動[14-15]。生物素不能人體合成, 必須通過含有或添加生物素的食品中獲得。經研究發現, 一般用1.0 mol/L硫酸提取植物源性食品中生物素[16]；而對動物源性食品中生物素則采用3.0 mol/L硫酸進行提取[17]。GB 5009.259-2016《食品安全國家標準 食品中生物素測定》對嬰幼兒配方食品中生物素則是采用3 %（約0.5 mol/L）硫酸進行提取[18]。為驗證3種不同濃度的硫酸對嬰幼兒配方奶品中生物素的提取效果, 用微生物法測定進行比較。最后基于該提取生物素方法, 通過實驗室間比對的方式, 對微生物法測定嬰幼兒配方食品中生物素的精密度進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉（AR）、無水乙醇（AR）、硫酸（98%）（AR）、氫氧化鈉（AR）, 天津市科密歐化學試劑有限公司；生物素標準品（C10H16N2O3S, CAS：58-85-5, 純度≥98 %）, 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；乳酸桿菌瓊脂培養基, 美國BD Difco；乳酸桿菌肉湯培養基, 美國BD Difco；生物素測定用培養基, 美國BD Difco。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱, 德國MMM；722分光光度計, 上海光譜儀器；電子分析天平, 北京賽多利斯；pH計, 北京賽多利斯；蓋勃離心機；破壁料理機, 美國Westinghouse。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備[18-22]

將實驗用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum,ATCC 8014）菌株活化后, 接種到乳酸桿菌瓊脂培養基上, 36±1℃培養16～24 h, 再轉種2代～3代來增強活力。將24 h內活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養基中, 36±1℃培養16～24 h, 以大于3 000轉/min離心5 min, 棄去上清液, 加入10 mL生理鹽水, 用渦旋混合器振蕩該懸液。再離心5 min, 棄去上清液。如前操作清洗2～3次后, 再加10 mL生理鹽水, 混勻。吸取0.5～1.0 mL該菌懸液于10 mL生理鹽水中, 混勻制成測試菌懸液。以生理鹽水做空白, 用分光光度計于550 nm波長下測定測試菌懸液透光率T（%）, 調整上述菌液加入量, 使測試菌懸液透光率在60%～80%。

1.3.2 測定用樣品及制備和保存

1.3.2.1 測定用樣品信息

1#嬰幼兒配方粉（中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心的質控樣品, 證書編號為803IP04051, Lot 2017.09.19）；特殊醫學用途嬰兒配方奶粉：2#氨基酸配方, 適用于食物蛋白過敏嬰兒, 0～12個月適用, 未添加乳糖（Lot 2017.09.19）；3#無乳糖配方粉, 0～12個月乳糖不耐受嬰兒（Lot 20180114）；4#早產兒/低體重出院后配方粉, 0～12個月出院后的早產兒（Lot 20180205）；5#乳蛋白深度水解配方（Lot 05/26/11）；6#乳蛋白部分水解嬰兒配方乳粉, 0～1個月（Lot 2017.09.12）。6個樣品用1#～6#表示。

1.3.2.2 測定用樣品制備和保存

1#嬰幼兒配方粉, 每個包裝冷凍到-20℃存放, 使用前恢復室溫使用。

特殊醫學用途嬰兒配方食品2#～6#, 均質后分裝成小包裝, 室溫避光封口保存。

1.3.2.3 參與實驗室間比對的實驗

A為本實驗室（北方）, B為本地社會第三方實驗室（北方）, C為本地質監系統實驗室（北方）, D為質檢系統實驗室（南方）；E為藥監系統實驗室（南方）。

5家實驗室用A-E表示。

1.3.3 實驗方法

1.3.3.1 樣品的測定

1#嬰幼兒配方粉和2#～6#特殊醫學用途嬰兒配方食品：分別加入50 mL 3、1 mol/L和0.5 mol/L硫酸在121℃下水解30 min。

以上樣品經硫酸高壓水解后, 取出迅速水浴冷卻至室溫。用氫氧化鈉溶液調節pH至4.5±0.2, 移入250 mL容量瓶中用水定容至刻度。用定量濾紙過濾, 最初約10 mL濾液應棄去, 吸取5 mL濾液于100 mL燒杯中, 加水約20 mL, 用氫氧化鈉溶液調節pH至6.8±0.2, 移入100 mL容量瓶中加水定容至刻度。標準曲線和樣品測定參照GB 5009.259-2016《食品安全國家標準 食品中生物素測定》[18、23-26]。

1.3.3.2 實驗室間重復性和再現性證實實驗[27-29]

實驗室間方法驗證方法參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》[30]。算上本中心共5家實驗室參與本次實驗室間驗證, 其中6個樣品為6個水平, 每個樣品測定7次。

2 結果與分析

2.1 食品中生物素提取條件的確定

用1#嬰幼兒配方粉分別進行提取預試驗, 3個樣品分別同時用0.5 mol/L硫酸溶液、1 mol/L硫酸溶液和3 mol/L硫酸溶液進行121℃下水解30 min前處理, 水解后, 快速冷卻到室溫后觀察, 見表1。

表1 1#樣品在不同濃度硫酸水解的結果比對試驗

2.2 精密度值（重復性和再現性）證實實驗[30]

2.2.1 原始數據和實驗室內均值

為方法驗證各個實驗室的原始數據, 并求出了實驗室內算術均值。驗證數據為各個實驗室獨立測定并出具, 加蓋各個實驗室公章, 見表2。

表2 原始數據和實驗室內均值

（續表2）

2.2.2 一致性和離群值的檢驗

根據表2進行一致性和離群值的檢查, 采用了檢驗一致性的方法（曼德爾h統計量和曼德爾k統計量）, 和檢驗離群值的數值方法（科克倫檢驗Cochran和格拉布斯檢驗Grubbs）。具體計算公式參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》[30]計算出曼德爾統計量k和h, 并繪制出圖1和圖2。并根據2.2.3.4（1）顯著水平為5 %、1 %時曼德爾統計量h的臨界值和2.2.3.5（1）顯著水平為5 %、1 %時曼德爾統計量k的臨界值進行判定。

2.2.2.1 曼德爾h統計量和曼德爾k統計量

由表2可知, 對每個實驗室的每個水平, 計算實驗室間的一致性統計量h（曼德爾h統計量）, 如圖1所示。

由圖1可知, 5個實驗室都處于正確值范圍內, 可以進一步驗證, 對每個實驗室, 計算實驗室內的一致性統計量k（曼德爾k統計量）, 如圖2所示。

圖1 實驗室進行分組的實驗室間一致性曼德爾統計量

圖2 實驗室進行分組的實驗室間一致性曼德爾統計量

由圖2可知, 根據B實驗室、第6水平和E實驗室第2水平為歧離值；D實驗室的第2、4水平為統計離群值；E實驗室第5水平為統計離群值。

2.2.2.2 科克倫檢驗（Cochran離群值檢驗）

科克倫檢驗為實驗室內變異的檢驗, 根據表2具體計算公式參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》[30], 并根據表3柯克倫檢驗的臨界值進行判定。

由表3可知, D實驗室第2、4水平是歧離值；E實驗室第5水平是統計離群值, 與曼德爾的k統計量一致。

表3 科克倫統計量（C）

2.2.3 格拉布斯檢驗（Grubbs檢驗）

根據表2, 當實驗室數量為5個時, 具體計算公式參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》[30]中格拉布斯檢驗的臨界值如（1）、（2）進行判定：

（1）一個最大（?。┲礕P（G1）：上5 %點的臨界值=1.715, 上1 %點的臨界值=1.764；

（2）兩個最大（小）GP-1,P（G1,2）值：下1 %點的臨界值=0.0018, 下5 %點的臨界值=0.0090。

2.2.3.1 實驗室內部格拉布斯檢驗

（1）根據表2和表3中的歧離值, D實驗室第2水平和D實驗室第4水平進行實驗室內部格拉布斯檢驗。

（2）根據表2和曼德爾k統計量中的歧離值, 對B實驗室第6水平, E實驗室第2水平這兩個歧離值進行法格拉布斯檢驗, 經判定B實驗室第6水平7個數據中最大值14.2μg/100 g的離散度和標準偏差大于其他數據, 按標準要求, 予以剔除。E實驗室第2水平7個數據都是正確值, 均保留。

2.2.3.2 實驗室間的格拉布斯檢驗

按照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》[30]中的規定, 科克倫統計量（C）、曼德爾h統計量、曼德爾k統計量中出現的統計離群值, 考慮剔除部分數據或者該實驗室全部數據。對歧離值在優化實驗的基礎上考慮保留或者剔除。

（1）根據表2、曼德爾k統計量中以及表3的統計離群值, 進行第2水平5個實驗室進行格拉布斯檢驗。由2.2.3.1（1）可知, D實驗室第2水平7個數據進行實驗室內部格拉布斯檢驗也均為正確值。對D實驗室剔除后, 按照其余4個實驗室的總平均值升序重新排序B 9.93μg/100 g＜A 10.40μg/100 g＜C 10.95μg/100 g＜E 13.43μg/100 g, 再進行格拉布斯檢驗。經判定第2水平D實驗室所有數據是否剔除, 不影響第2水平的格拉布斯的檢驗結果, 可以剔除。

（2）根據表2和曼德爾k統計量中的統計離群值, 進行第2水平5個實驗室進行格拉布斯檢驗。由2.2.3.1（2）可知, E實驗室第2水平7個數據進行實驗室內部格拉布斯檢驗也均為正確值。對E實驗室剔除后, 按照其余4個實驗室的總平均值升序重新排序B 9.93μg/100 g＜A 10.40μg/100 g＜C 10.95μg/100 g＜D 14.34μg/100 g, 再進行格拉布斯檢驗。經判定第2水平E實驗室所有數據是否剔除, 不影響第2水平的格拉布斯的檢驗結果, 可以剔除。

（3）根據表2和曼德爾k統計量中的統計離群值, 進行第2水平5個實驗室進行格拉布斯檢驗。由2.2.3.1可知, 對D、E兩個實驗室剔除后, 按照其余3個實驗室的總平均值升序重新排序B 9.93μg/100 g＜A 10.40μg/100 g＜C 10.95μg/100 g, 再進行格拉布斯檢驗。經判定第2水平D、E兩個實驗室所有數據是否剔除, 不影響第2水平的格拉布斯的檢驗結果, 可以剔除。但是（1）～（3）是否合理, 還需要進一步驗證。

（4）根據表2、曼德爾k統計量中以及表3的統計離群值, 進行第4水平5個實驗室進行格拉布斯檢驗。由2.2.3.1（1）可知, D實驗室第4水平7個數據進行實驗室內部格拉布斯檢驗也均為正確值。對D實驗室剔除后, 按照其余4個實驗室的總平均值升序重新排序E 11.13μg/100 g＜B 11.74μg/100 g＜A 16.29μg/100 g＜C 16.41μg/100 g, 再進行格拉布斯檢驗。第4水平D實驗室所有數據是否剔除, 不影響第4水平的格拉布斯的檢驗結果, 可以剔除。

（5）根據表2、曼德爾k統計量中以及表3的統計離群值, 對E實驗室第5水平, 進行格拉布斯檢驗, 經判定E實驗室第5水平7個數據中最大值26.6μg/100 g的離散度和標準偏差大于其他數據, 按標準要求, 歧離值考慮剔除。

（6）根據表2、曼德爾k統計量中以及表3的統計離群值, 第5水平的E實驗室的整組數據需要剔除。但是為了謹慎起見, 先對第5水平的5個實驗室分別進行格拉布斯檢驗, 按照5個實驗室的總平均值升序重新排序B 19.23μg/100 g＜E 21.68μg/100 g＜A 26.43μg/100 g＜C 27.93μg/100 g＜D 29.94μg/100 g, 經判定5個實驗室格拉布斯檢驗都合格。

（7）根據表2、曼德爾k統計量中以及表3的統計離群值, 對第5水平5個實驗室進行格拉布斯檢驗。由（6）可知, 最大值26.6μg/100 g先考慮剔除, 再參與5個實驗室的格拉布斯檢驗。剔除后的6組數據平均值依然為21.68μg/100 g。將剔除后的數據, 按照5個實驗室的總平均值升序重新排序, 發現排序與（2）一致, 再進行格拉布斯檢驗。E實驗室第5水平7個數據的最大值26.6μg/100 g是否剔除, 都不影響格拉布斯檢驗, 可以剔除。

（8）根據表2和曼德爾k統計量中的統計離群值, 進行第6水平5個實驗室進行格拉布斯檢驗。由2.2.3.2可知, 將剔除后的數據按照5個實驗室的總平均值升序重新排序E 10.2μg/100 g＜B 11.00μg/100 g＜A 13.90μg/100 g＜C 15.60μg/100 g＜D 20.37μg/100 g, 進行格拉布斯檢驗, 經判定5個實驗室格拉布斯檢驗都符合條件。

2.2.3.3 5個實驗室及6個樣品水平的格拉布斯檢驗結果

根據《表3科克倫統計量（C）》和曼德爾k統計量, 分別對歧離值、統計離群值進行實驗室內部、實驗室間的格拉布斯檢驗得出結論, 見表4。

表4 5個實驗室及6個樣品水平的格拉布斯檢驗結果

根據表4我們將重新進行曼德爾h統計量、曼德爾k統計量、柯克倫（C）檢驗, 再次對剔除值、剔除實驗室進行判定。

2.2.3.4 曼德爾h統計量再次判定

由于曼德爾h統計量只考查實驗室間的一致性, 所以顯著水平不用考慮剔除值對其的影響。

（1）當P=5顯著水平5 %臨界線±1.57, 顯著水平1 %臨界線±1.72；

（2）當P=4顯著水平5 %臨界線±1.42, 顯著水平1 %臨界線±1.49；

（3）當P=3顯著水平5 %臨界線±1.15, 顯著水平1 %臨界線±1.15。見表5。

表5 曼德爾的h統計量（實驗室間一致性）

由表5可知, 第2水平、第4水平, 按照（2）判定, 均為正確值；其余水平按照（1）判定, 均為正確值。

2.2.3.5 曼德爾k統計量再次判定

由于曼德爾k統計量考查實驗室內部的一致性, 所以顯著水平不僅要考慮剔除實驗室對其的影響, 還要考慮實驗數據個數對其的影響。

（1）當P=5, n=7顯著水平5 %臨界線1.39, 顯著水平1 %臨界線1.55；

（2）當P=5, n=6顯著水平5 %臨界線1.42, 顯著水平1 %臨界線1.59；

（3）當P=4, n=7顯著水平5 %臨界線1.37, 顯著水平1 %臨界線1.51；

（4）當P=3, n=7顯著水平5 %臨界線1.34, 顯著水平1 %臨界線1.46, 見表6。

表6 曼德爾的k統計量（實驗室內部一致性）

由表6可知, 其中第5水平、第6水平, 按照（1）、（2）判定, 其中第2水平、第4水平按照（3）判定, 其中第2水平E實驗室為歧離值, 其余均為正確值；其余按照（1）判定, 均為正確值。

2.2.3.6 柯克倫（C）檢驗再次判定

由于柯克倫（C）檢驗考查實驗室內部的變異, 所以顯著水平不僅要考慮剔除實驗室對其的影響, 還要考慮實驗數據個數對其的影響。

（1）當P=5, n=7顯著水平5 %臨界線0.4783, 顯著水平1 %臨界線0.5531；

（2）當P=5, n=6顯著水平5 %臨界線0.5060, 顯著水平1 %臨界線0.5880；

（3）當P=4, n=7顯著水平5 %臨界線0.5598, 顯著水平1 %臨界線0.6410；

（4）當P=3, n=7顯著水平5 %臨界線0.6771, 顯著水平1 %臨界線0.7606, 見表7。

表7 科克倫統計量（C）

由表7可知, 第5水平、第6水平, 按照（1）、（2）判定, 均為正確值；第2水平、第4水平按照（3）判定, 均為正確值；其余按照（1）判定, 均為正確值。

由2.2.3.4～2.2.3.6可知, 曼德爾h統計量、曼德爾k統計量、柯克倫（C）檢驗完全驗證了之前的格拉布斯檢驗對5個實驗室、6個樣品水平的數據剔除、實驗室剔除的正確性。我們只需再對曼德爾k統計量中其中第2水平E實驗室這個歧離值, 進行實驗室內部、實驗室間的格拉布斯檢驗, 就可以知道這兩個值是否進行取舍。

2.2.3.7 對曼德爾k統計量再次判定的歧離值進行格拉布斯檢驗

對第2水平E實驗室進行實驗室內部和實驗室間的格拉布斯檢驗。根據2.2.3.2（1）～（3）可知, 第2水平剔除E實驗室后, 不影響其格拉布斯檢驗結果, 但是是否剔除E實驗室, 還要根據最后的重復性方差和再現性方差決定。

2.3 總平均值和方差Srj、SRj的計算[30]

具體計算公式參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》[30]計算出總平均值和方差Srj、SRj。由2.2.3.3～2.2.3.6可知, 進行未剔除第2水平D實驗室和第4水平E實驗室和剔除第2水平D實驗室和第4水平E實驗室的總平均值和標準差Srj、SRj的比較。見表8和表9。

由表8可知, 當第2水平未剔除E實驗室時, 重復性標準差Srj=5.4956, 再現性標準差SRj=5.4965。

表8 未剔除第2水平E實驗室的總平均值和標準差Srj、SRj

表8 未剔除第2水平E實驗室的總平均值和標準差Srj、SRj

項目（μg/100 g） 1# 2# 3# 4# 5# 6#總平均值images/BZ_54_1552_442_1584_472.png 25.32 11.18 15.32 13.89 25.04 14.21重復性方差S2rj 130.0011 30.2013 41.9920 52.1229 1.3197 0.6316再現性方S2Rj=S2rj+S2Lj 130.0303 30.2113 41.9341 52.0963 2.5585 1.6698 Srj 11.4018 5.4956 6.4801 7.2196 1.1488 0.7947 SRj=(S2rj+S2Lj)1/2 11.4031 5.4965 6.4757 7.2178 1.5995 1.2922

由2.2.3.7可知, 再計算剔除第2水平E實驗室的總平均值, 見表9。

表9 剔除第2水平E實驗室后的總平均值和標準差Srj、SRj

表9 剔除第2水平E實驗室后的總平均值和標準差Srj、SRj

項目（μg/100 g） 1# 2# 3# 4# 5# 6#總平均值images/BZ_54_1552_442_1584_472.png 25.32 10.43 15.32 13.89 25.04 14.21重復性方差S2rj 130.0011 8.9198 41.9920 52.1229 1.3197 0.6316再現性方S2Rj=S2rj+S2Lj 130.0303 8.8997 41.9341 52.0963 2.5585 1.6698 Srj 11.4018 2.9866 6.4801 7.2196 1.1488 0.7947 SRj=(S2rj+S2Lj)1/2 11.4031 2.9832 6.4757 7.2178 1.5995 1.2922

由表9可知, 當第2水平剔除E實驗室時, 重復性標準差Srj=2.9866, 再現性標準差SRj=2.9832。第2水平E水平剔除歧離實驗室后的重復性標準差和再現性標準差明顯小于未剔除前, 即第4水平剔除E實驗室全部數據。

根據2.2～2.3可知, 我們對5個實驗室對6個樣品水平的實驗數據進行取舍, 最后得出如下的結論, 見表10。

表10 5個實驗室及6個樣品水平實驗數據進行取舍的最后結果

2.4 精密度值（重復性和再現性）和平均水平之間的函數關系的建立

表11 總平均值升序排列

表11 總平均值升序排列

實驗室（μg/100 g）2# 4# 6# 3# 5# 1# 平均值images/BZ_54_1552_442_1584_472.png 10.4 13.9 14.2 15.3 25.0 25.3 17.35 Srj 3.0 7.2 0.8 6.5 1.1 11.4 5.00 SRj 3.0 7.2 1.3 6.5 1.6 11.4 5.17

由表11可知, 具體公式以及判定參照GB/T 6379.2-2004《測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法》[30], 對重復性標準差Srj和再現性標準差SRj考慮以下3種類型的關系式：

（1）關系式Ⅰ：s=bm（通過原點的直線）；

（2）關系式Ⅱ：s=a+bm（截距為正的直線）；

關系式Ⅲ：lgs=c+dlgm（或s=Cmd）, d≤1（指數關系）, 見表12。

由表12可知, 根據相關系數R2判定, 關系式關系式Ⅰ和關系式Ⅱ最好。但是根據變異系數（100 S/m）%是一個常數的要求, 關系式Ⅰ：重復性標準差Srj=30%和再現性標準差SRj=31%。當min=10.4μg/100g和max=25.3μg/100g時, 關系式Ⅱ：重復性標準差Srjmin=112.9 %、Srjmax=117.08%和再現性標準差SRjmin=150.52%、SRjmax=169.89%, 顯然不理想。所以關系式Ⅰ：重復性標準差Srj=30 m和再現性標準差SRj=31 m最好。

表12 精密度值（重復性和再現性）和平均水平之間的函數關系

表12 精密度值（重復性和再現性）和平均水平之間的函數關系

關系式 Ⅰ Ⅱ ⅢSrj SRj Srj=0.30m相關系數R2=1.0000 SRj=0.31m相關系數R2=1.0000 Srj=1.1+0.0028m相關系數R2=1.0000 SRj=1.37+0.013m相關系數R2=1.0000 lgSrjj=0.28-0.086gm(或Srj=0.28m-0.086)相關系數R2=0.9999 lgSRj=0.31+0.14gm(或SRj=0.31m0.14)相關系數R2=0.9930

3 結論

3.1 嬰幼兒配方食品中生物素提取條件的確定

0.5、1 、3 mol/L 3種硫酸溶液處理后的1#樣品顏色深淺為0.5 mol/L＜1 mol/L＜3 mol/L, 顏色逐漸加深, 并且樣品都能過濾且正常, 可見這3個濃度的硫酸溶液都可以使用。對于1#嬰幼兒配方粉（質控樣品）, 生物素標準值為28.0μg/100 g。用0.5 mol/L硫酸溶液進行121℃下水解30 min前處理后, 兩次測出的結果分別為28.2μg/100g、28.7μg/100g。通過實驗可以看出隨著硫酸溶液的濃度提高, 生物素的含量下降, 所以嬰幼兒配方食品用0.5 mol/L硫酸溶液進行前處理。

3.2 精密度值（重復性和再現性）的確定