貓傳染性腹膜炎病毒PL1蛋白抑制宿主細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生機(jī)制的研究

蔡冬冬，張 輝，王正義，羅 毅，劉伽均，李 春，胡曉亮，田志革*

（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部，動(dòng)物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株和質(zhì)粒 FIPV DF2株、仙臺(tái)病毒（Sendai virus，SeV）、螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒、轉(zhuǎn)錄因子PRDⅢ/Ⅰ、NF-κB 和AP-1 報(bào)告質(zhì)粒、RIG-1、MAVS、STING和TBK-1，均由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；CRFK細(xì)胞、空載體質(zhì)粒p3×flag和pUb由“動(dòng)物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”保存；大腸桿菌感受態(tài)Trans5α購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要試劑 鼠抗flag 單抗、兔抗GAPDH 單抗、抗IRF3-S396、抗IRF3 抗體，均購于Sigma 公司；質(zhì)粒提取試劑盒，購于AXYGEN公司；膠回收純化試劑盒，購于OMEGA 公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒，購自Promega 公司；DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，購于Hyclone 公司；胎牛血清，購自Hyclone公司；胰酶，購于Gibco BRL公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，購于Invitrogen 公司；Tween-20、30%聚丙烯酰胺等試劑，購于索萊寶公司；PVDF 膜，購自Millipore 公司；RAPI 裂解液，購自碧云天公司。

1.3 FIPV PL1 基因的PCR 擴(kuò)增 根據(jù)FIPV DF2 株（GenBank 登錄號(hào)：JQ408981）的PL1 基因（3566-4355位點(diǎn)），使用Oligo軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物：5′-TTTAAGCTTTCCTTGACCCCATTCA AGACA-3′，下游引物：5′-TTTGAATTCTTAATCT TTAGGACTTTGACAGTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為792 bp。

1.4 PL1 蛋白抑制宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的機(jī)制研究 轉(zhuǎn)染前一天，將CRFK 細(xì)胞均勻鋪于24孔板中，待細(xì)胞長成單層且密度達(dá)到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系中有1 μg PL1及其突變體質(zhì)粒，300 μL DMEM 無血清培養(yǎng)液，3 μL 轉(zhuǎn)染試劑，10 ng RL-TK 內(nèi)參質(zhì)粒。依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康模謩e另向體系中加入600 ng IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRD Ⅲ/Ⅰ-Luc或AP-1-luc報(bào)告質(zhì)粒，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置空載體對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后，每孔加入100 HAU的SeV，12 h后棄去上清，用裂解液將細(xì)胞裂解10 min，8 000 r/min 離心5 min 后取20 μL裂解液進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定。

1.5 激光共聚焦試驗(yàn) 將293T細(xì)胞接種到激光共聚焦小皿中培養(yǎng)過夜。將PL1 蛋白與空載體p-flag 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，并用0.1% TritonX-100 透膜15 min，用5%脫脂乳封閉1 h 后，加入抗IRF3 和抗IRF3-S396 抗體（1∶1 000）稀釋，37 ℃孵育1 h，用PBS洗滌3次，分別加入抗兔和抗人抗體作為二抗，在37℃孵育1h，隨后用PBS 洗滌3 次，DAPI 染色15 min，洗滌3次，最后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 免疫印跡試驗(yàn) 將PL1 蛋白與p-flag 載體分別與pUb 載體共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，接種SeV（100 HAU）12 h 后，收集細(xì)胞裂解液，經(jīng)過13 000 r/min離心5 min后取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，37 ℃封閉2 h，分別加入抗IRF3、抗IRF3-S396 抗體（1∶1 000）和HA 抗體（1∶3 000）后，加入抗兔和抗人抗體作為二抗，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PL1 蛋白抑制IFN-β啟動(dòng)子活性 為驗(yàn)證PL1 蛋白能否抑制IFN-β啟動(dòng)子的激活，將PL1與IFN-β啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染CRFK 細(xì)胞，結(jié)果顯示PL1 能夠抑制SeV 誘導(dǎo)的INF-β啟動(dòng)子的激活（圖1-A）。但是INF-β啟動(dòng)子含有3種轉(zhuǎn)錄因子PRDⅢ/Ⅰ、NF-κB 和AP-1，為進(jìn)一步確定PL1 蛋白抑制哪一種轉(zhuǎn)錄因子，將PL1 蛋白與3 種轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子載體共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后加入SeV，采用上述方法處理細(xì)胞后，檢測(cè)熒光素酶強(qiáng)度。結(jié)果表明PL1蛋白能夠抑制全部3種轉(zhuǎn)錄因子并且呈劑量依賴性（圖1-B、C、D）。說明PL1 蛋白具有抑制IFN-β啟動(dòng)子的能力，并且能夠抑制3 種轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子的活性。

圖1 PL1蛋白抑制IFN-β啟動(dòng)子活性

2.2 PL1 蛋白抑制IRF3 磷酸化 為了驗(yàn)證PL1是否影響IRF3的磷酸化，將PL1轉(zhuǎn)染293T后，分別接種SeV（HA＝100），24 h 后分別進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果與SeV誘導(dǎo)后相比，PL1蛋白能夠明顯下調(diào)IRF3的磷酸化（圖2）。

圖2 PL1抑制IRF3磷酸化

2.3 PL1 依賴催化活性抑制IFN-β的表達(dá) 為了確定PL1介導(dǎo)的抑制IFN-β表達(dá)是否依賴其催化活性，將PL1 突變體（C32A、H183A 和D196A）與RIG-1、MAVS、STING和TBK-1、IFN-β-Luc和pRL-TK 共轉(zhuǎn)染293T 后，接種SeV，24 h 后檢測(cè)Luciferase值。結(jié)果表明：與PL1相比，PL1的突變體（C32A 和H183A）幾乎完全喪失對(duì)抗IFN-β啟動(dòng)子活性的能力，而D196A 僅僅有部分抑制活性。基于此，我們確認(rèn)PL1蛋白抑制IFN-β啟動(dòng)子的活性需要被催化。PL1 能夠分別抑制RIG-1、MAVS、STING 和TBK-1 誘導(dǎo)的IFN-β 的激活（圖3）。

圖3 FIPV PL1突變體與IFN-β-Luc的關(guān)系

2.4 PL1 利用DUB 活性降低Ub 的泛素化 上述試驗(yàn)證明PL1 蛋白能抑制IFN-β啟動(dòng)子活性，而PL1 突變體不具有其活性，PL1 的催化活性區(qū)域負(fù)責(zé)蛋白的去泛素化，這說明PL1 蛋白可能依賴于其蛋白酶活性。我們通過Western blotting實(shí)驗(yàn)證明PL1 蛋白具有去泛素化活性，而PL1 的突變體并不存在去泛素化活性（圖4）。

圖4 PL1蛋白的去泛素化活性

3 討論

CoV-NL63 的PL 和SARS-CoV 的PL 既能通過抑制IRF-3 的磷酸化和核轉(zhuǎn)移阻斷IFN 的合成，又能抑制STING 介導(dǎo)的IFN-3 的核轉(zhuǎn)移［1］。細(xì)胞中表達(dá)野生型和催化突變PL2-TM能夠降低STING、RIG-1、TBK-1和IRF-3的泛素化水平，這些都可能影響IFN誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。MHV的PL2明顯抑制CARDIF、TBK-1和IRF-3介導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子激活，還能與IRF-3 結(jié)合抑制其核轉(zhuǎn)移利用其去泛素化活性［2］。PEDV 的PL2 和TGEV 的PL1作為病毒的去泛素化酶干擾RIG-1和STING介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。冠狀病毒利用PL 的酶活性逃避宿主固有免疫抗病毒反應(yīng)。FIPV PL1 具有與TGEV PL1 相似的結(jié)構(gòu)，后者具有去泛素化酶活性，因此推測(cè)FIPV PL1 也可能有此活性和功能。本研究發(fā)現(xiàn)FIPV PL1 抑制IFN-β啟動(dòng)子的表達(dá)和IRF-3的移核通過其催化活性區(qū)。

泛素化和去泛素化是病毒誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)方式［4］。RIG-1 通過E3 泛素化連接酶（TRIM25），引起下游Ⅰ型IFNs 的信號(hào)表達(dá)盒［5］。很多病毒具有去泛素化酶活性，比如口蹄疫病毒的Lpro［6］，人巨細(xì)胞病毒的UL48［7］，單純皰疹病毒的UL36［8］和豬繁殖與呼吸合征病毒的nsp2 蛋白［9］。所有的冠狀病毒都編碼去泛素化酶，這可能會(huì)調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)FIPV PL1 的3 個(gè)催化活性中心的突變能夠使去泛素化作用失活，不能抑制病毒誘導(dǎo)的IFN-β的激活，說明FIPV PL1 的去泛素化作用直接涉及Ⅰ型干擾素的抑制作用。