濕酒糟中乙醇等九種成分分析及其體外拮抗物質的篩選

李前勇，張芝金，羅怡茜，郭靈君，張德志，張余蓬，朱 瑞

（1.西南大學動物醫學院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市獸醫工程技術研究中心，重慶 榮昌 402460；3.重慶市肉牛工程技術研究中心，重慶 榮昌 402460）

酒糟（DG）是利用谷類進行釀酒發酵、蒸餾處理后的副產物，白酒、啤酒的釀造及燃料乙醇的生產均可產生酒糟［1］。我國白酒釀造歷史悠久，啤酒等各類酒精飲料產業興旺發達，也是世界上第三大燃料乙醇的生產和消費國［2］，每年可產出各類酒糟1 億噸以上［3］。因酒糟中各類營養物質較為豐富，用于動物飼料比較普遍。然而，酒糟中不僅含有可利用的營養素，還含有乙醇、乙酸、甲醛等對動物健康有一定傷害的物質，可能引發的動物酒糟中毒［4-5］。

鑒于此，本研究采用氣相色譜、高效液相色譜技術測定了國產濕酒糟（白酒糟、啤酒糟）中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛等9種物質的含量，分析其存儲過程中的變動規律，并針對酒糟中乙醇、甲醛等含量較高的物質開展拮抗物質的體外篩選，以期獲得國產酒糟中常見毒性成分的具體含量數據，為預防畜禽生產中濕酒糟引發的動物中毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 酒糟樣品的采集 隨機采集川渝地區大酒廠、小酒廠鮮高梁型白酒糟（高粱渣占95%左右，糠殼及發酵菌殘體等占5%）及啤酒廠新鮮啤酒糟各35 kg，置于潔凈塑料袋內運回。隨機采取每種類型酒廠的酒糟10份，200 g/份，置潔凈采樣袋內，做好標記后-80 ℃保存備用。另外，隨機采取每種類型酒廠的酒糟15份，2000g/份，置潔凈小型塑料桶內，隨機分為三組，5 份/組，按照酒糟的塑料袋存儲法，將酒糟裝入干凈的專用塑料袋內，壓實后密封，1、2、3 組分別于室溫下避光保存7、15、30 d，勿使樣品霉?。辉儆诟鞅４鏁r間點按150 g/份隨機采樣10份，-80 ℃保存備用。

1.2 主要儀器及藥品 氣相色譜儀（GC-6280），高效液相色譜分析儀（Agilent-1100），0.45 μm 濾膜（HVLP-1450），超純水系統（Mili-Q），電子天平（Secura125-1CN），無菌均質器（Scientz-IIL），超聲振蕩器（KQ5200B）；磷酸（GR 級），甲醇（色譜純）、乙醇（色譜純）、戊醇（色譜純）、正丙醇（色譜純）、異戊醇（色譜純）、異丁醇（分析純）、甲醛（分析純）、乳酸（分析純）、乙酸（分析純），碳酸氫鈉（分析純）、氧化鎂（分析純）、氧化鈣（分析純）、膨潤土、腐植酸鈉（精制）、蒙脫石（K-10）、分子篩（ZSM-5）。

1.3 試驗方法

1.3.1 酒糟中甲醇、乙醇、戊醇、正丙醇、異戊醇、異丁醇、甲醛含量的測定 精確稱取酒糟樣品10 g，加超純水15 mL，然后均質粉碎，振蕩混勻后置冰水溶液中60% P（P＝400 W）超聲提取1 h；再定容至20 mL，密封，4 ℃下冷浸過夜萃取，最后10 000 r/min 離心10 min，取上清過0.45 μm 濾膜，留濾液待測。

樣品中甲醇、乙醇等7 種成分均采用GC-6280 氣相色譜儀檢測，檢測器為FID，色譜柱為DB-FFAP（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）。升溫程序為：初始柱溫35 ℃保持8 min；8～12 min，以5 ℃/min 升至60 ℃；12～20.5 min，以20 ℃/min升溫至230 ℃；保持2 min。進樣口溫度為230 ℃，檢測器溫度為250 ℃；載氣為高純氮氣，流量為2.0 mL/min；進樣口分流比為15∶1，進樣體積為1 μL。

取甲醇、乙醇、正丙醇、異戊醇、異丁醇標準品，均用超純水稀釋、定容至2.5、5、10、25、50、100 μg/mL 濃度，戊醇標準品稀釋、定容至3、6、12、30、60 μg/mL 濃度，甲醛標準品稀釋、定容至0.012、0.06、0.12、0.24、0.3、0.6 μg/mL 濃度，上機檢測，以峰面積為橫坐標、標準測定液濃度為縱坐標繪制標準曲線，運用Excel 中的Linest 函數計算其斜率、截距、相關系數、截距標準誤，并 利用公式“檢測限（LOD）＝3.3 δ/S，定量限（LOQ）＝10δ/S”計算各標準物質的LOD、LOQ。參照文獻［6］進行甲醇、乙醇、正丙醇、戊醇、異戊醇、異丁醇、甲醛的精密度、回收率試驗。將樣品組分測得的峰面積代入標準曲線公式，計算出待測液中相應組分的濃度。

1.3.2 酒糟中乙酸、乳酸含量的測定 精確稱取酒糟樣品10 g，均質機搗碎，轉移至20 mL 容量瓶內，加入超純水15 mL，室溫避光60% P（P＝400 W）超聲提取30 min；取出，用超純水定容至20 mL，混勻，然后取上清液過0.45 μm濾膜，留濾液待測。

樣品中乙酸、乳酸均采用Agilent-1100 高效液相色譜分析儀檢測，方法參照文獻［7］。色譜柱為TSKgel ODS-100V（4.6 mm×250 mm×5.0 μm），流動相為0.1%磷酸水溶液，流速為1 mL/min；紫外檢測器，檢測波長為210 nm；柱溫為40 ℃，進樣體積20μL。

取乙酸、乳酸標準品，均精確配制4、20、32、40、64、80 μg/mL 濃度梯度，上機檢測，以峰面積為橫坐標、標準測定液濃度為縱坐標繪制標準曲線，按“1.3.1”方法計算相關系數、標準物質的LOD、LOQ。參照文獻［8］進行乙酸、乳酸測定的精密度、回收率試驗。將樣品組分測得的峰面積代入標準曲線公式，計算出待測液中乙酸、乳酸的濃度。

1.3.3 酒糟中主要毒性成分體外拮抗物質的篩選 取儲存7 d 未發霉符合質量要求的白酒糟（濕，小廠）隨機分為18 組，第1～17 組為試驗組，第18 組為對照組（500 g/組）。試驗組分別在酒糟中加入1.5%碳酸氫鈉、3%膨潤土，0.5%、1%、1.5%氧化鎂，1%、3%、5%腐植酸鈉，1%、3%、5%氧化鈣，1%、3%、5%蒙脫石，1%、3%、5%分子篩，混勻后室溫作用2 h，再采集酒糟試樣（30 g/份，每個添加比例組10 個重復），置潔凈樣品袋內，同時采集對照組樣品，-80 ℃下保存備用。依照“1.3.1”和“1.3.2”方法測定樣品中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛四種毒性成分的含量。

1.3.4 酒糟中水分的測定 精確稱取白酒糟、啤酒糟樣品各10份，50 g/份，采用GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》方法測定樣品中的水分含量。

1.3.5 數據統計 試驗所得數據經Excel 2016軟件整理，計算平均值xˉ和標準偏差SD，數據以xˉ±SD表示；用SPSS 19.0 軟件的單因素方差分析、LSD 多重比較法分析試驗組間及組內不同物質間平均含量的差異，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 各標準物質的保留時間、線性方程、相關系數 由圖1～圖3可知，9種標準物質均得到良好的分離，且峰形較好；表1 顯示，各種標準物質的相關系數均大于0.998，表明9種物質在相應的檢測方法下有良好的線性關系，可以很好地對6 種醇、甲醛、2 種酸進行定量檢測；檢測限和定量限均能滿足試驗要求。

表1 9種物質的保留時間、線性回歸方程、相關系數、檢測限和定量限

圖1 6種醇標準物質的氣相色譜圖

圖2 標準物質甲醛的氣相色譜圖

圖3 標準物質乙酸、乳酸的HPLC圖

2.2 精密度、回收率試驗 試驗測得9種物質的RSD（相對偏差）范圍為0.17%～0.48%，表明試驗所用方法有良好的精密度。

取小酒廠鮮白酒糟，分別測定甲醇等9 種物質的本底值，再在樣品中添加2 個濃度水平的標準物質進行回收率試驗，結果見表2。由表2 可知，9 種物質兩種不同添加量的回收率在93%～102.5%之間，表明試驗所用方法的回收率高，符合要求。

表2 9種物質回收率的測定

2.3 鮮酒糟中9 種成分的含量 參試酒糟樣品中水分的測定結果：大廠白酒糟為67.34%±5.71%，小廠白酒糟為71.61%±7.83%，啤酒糟為83.75%±6.72%。該結果用于后續試驗計算干酒糟各測定物質的含量。由表3 可知，幾種鮮酒糟中9種物質的含量各不相同，大廠的白酒糟、啤酒糟中乳酸＞乙酸＞乙醇＞甲醛（P＜0.05），甲醇和異戊醇含量均最低，正丙醇、異丁醇、戊醇均未檢出；小廠白酒糟中乳酸＞乙醇＞乙酸（P＜0.05），甲醛、異戊醇、正丙醇含量兩兩間無顯著差異（P＞0.05），但三者含量均顯著低于乙酸（P＜0.05），戊醇、甲醇含量最低（P＜0.05），異丁醇未檢出。同種物質在不同類型酒糟中的含量也不同，甲醇以啤酒糟中含量最高（P＜0.05），乙醇為小酒廠酒糟＞大酒廠酒糟＞啤酒糟（P＜0.05），正丙醇、戊醇以小廠白酒糟的含量最高（P＜0.05），其余未檢出；異戊醇為小廠白酒糟＞大廠白酒糟＞啤酒糟（P＜0.05），甲醛為白酒糟＞啤酒糟（P＜0.05），乙酸為大廠白酒糟＞小廠白酒糟＞啤酒糟（P＜0.01），大廠白酒糟的乳酸顯著高于其他兩種類型酒糟（P＜0.05）。所有酒糟中乙酸、乳酸、乙醇、甲醛的含量相對較高，乙醇含量范圍為299.64～11 667.45 mg/kg·DM，乙酸含量范圍為1.80～7.11 g/kg·DM，乳酸含量為25.41～92.90 g/kg·DM，甲醛含量為9.64～18.79 mg/kg·DM。

表3 鮮酒糟樣品中9種物質的含量

2.4 儲存酒糟中8 種物質含量的變化規律 三類酒糟中同一種物質在不同存儲時間的含量變化見圖4～圖11。由圖可知，酒糟中甲醇含量隨著儲存時間延長呈現顯著的增加，以啤酒糟最為明顯，儲存30 d 達到26.78±1.93 mg/kg·DM；大廠白酒糟和啤酒糟中的乙醇含量隨儲存時間延長呈現顯著的增加，儲存30d分別達到5331.53±138.48、7 362.26±93.99 mg/kg·DM，但小廠白酒糟中的乙醇含量在儲存15 d后有顯著下降；啤酒糟中正丙醇含量隨儲存時間延長顯著增加，小廠白酒糟只是在儲存7 d 時有顯著增加；小廠白酒糟中的戊醇含量在存儲15 d后呈現顯著下降；大廠白酒糟和啤酒糟中的異戊醇含量在儲存7、15 d 時顯著增加，小廠白酒糟的異戊醇含量在儲存7 d 及以后顯著增加。

圖4 儲存酒糟中甲醇的含量變化

圖5 儲存酒糟中的乙醇含量變化

圖6 儲存酒糟中正丙醇的含量變化

圖7 儲存酒糟中異戊醇的含量變化

圖8 儲存酒糟中戊醇的含量變化

圖9 儲存酒糟中甲醛的含量變化

圖10 儲存酒糟中乙酸的含量變化

圖11 儲存酒糟中乳酸的含量變化

小廠白酒糟和啤酒糟中的甲醛含量隨儲存時間延長而增加，以啤酒糟儲存15d時達到最高值（208.62±5.87 mg/kg·DM），大廠白酒糟在儲存7、15d時甲醛含量顯著降低。大廠白酒糟和啤酒糟中的乙酸含量隨儲存時間延長而增加，以大廠白酒糟儲存15d時達到最高值（12.73±0.13g/kg·DM），小廠白酒糟中的乙酸含量隨儲存時間延長而降低。三種類型酒糟中的乳酸含量均隨儲存時間延長而出現顯著下降，以啤酒糟儲存30 d 時含量最低（1.98±0.42 g/kg·DM）。

2.5 酒糟中主要毒性成分體外拮抗物質的篩選 本試驗以酒糟中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛四種主要毒性成分為檢測對象，研究了碳酸氫鈉、膨潤土、氧化鎂等7種物質對其體外拮抗的作用（表4）。結果顯示，與對照組中的乙醇含量比較，酒糟經7種物質不同濃度處理后乙醇含量均極顯著降低（P＜0.01），其中，用1%蒙脫石和1%氧化鈣處理后乙醇的檢出量最低，其次是0.5%、1%氧化鎂，而1.5%碳酸氫鈉、5%氧化鈣和1%、3%分子篩的作用最差。除5%氧化鈣外，酒糟經7種物質不同濃度處理后乙酸含量均顯著降低（P＜0.05），其中，用1.5%碳酸氫鈉和1%、5%蒙脫石以及1.5%氧化鎂處理后乙酸的檢出量最低，其次是3%膨潤土、3%蒙脫石和0.5%、1%氧化鎂、1%腐植酸鈉，3%、5%氧化鈣的作用最差。除3%蒙脫石、1%和5%分子篩外，用7 種物質其他濃度處理后的酒糟，其乳酸含量均極顯著降低（P＜0.01），其中，用1.5%氧化鎂處理后乳酸的檢出量最低，其次是1%氧化鎂和3%、5%氧化鈣，1%、5%的分子篩和3%、5%蒙脫石的作用最弱。用不同濃度氧化鎂、氧化鈣、蒙脫石、分子篩處理后的酒糟，其甲醛含量均極顯著降低（P＜0.01），其中，3%、5%分子篩和3%、5%氧化鈣處理后甲醛的檢出量最低，其次為1%、1.5%氧化鎂、1%氧化鈣及1%分子篩，各濃度腐植酸鈉、1.5%碳酸氫鈉及3%膨潤土的作用最弱。

表4 不同濃度的7種物質對酒糟中4種主要毒性成分的處理效果

3 討論

本試驗基于我國白酒、啤酒的現行生產工藝，以獸醫內科教材記載的酒糟中的主要毒性成分為依據，檢測和分析了鮮濕高粱型白酒糟、儲存高粱型白酒糟及啤酒糟中9 種成分的含量。結果表明，鮮啤酒糟、不同類型酒廠的白酒糟中9 種成分的含量各不相同，但所有酒糟中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛的含量相對較高，異戊醇在三種酒糟中均能很好的檢出；儲存試驗期內，啤酒糟、大廠白酒糟中的乙醇、乙酸含量隨儲存時間延長而顯著增加，小廠白酒糟則呈現顯著下降；三種酒糟中的乳酸含量均隨儲存時間延長而出現顯著下降；啤酒糟和小廠白酒糟中的甲醛含量隨儲存時間延長而增加，大廠白酒糟在儲存15 d 后顯著降低。需要說明的是，我國幅員遼闊，各地釀造白酒的原料、工藝等差別較大，本試驗所得結果并不能完全反映各地酒糟中已測成分的含量，還需作進一步的研究。

Thokozani 等［9］研究指出，常人若每天攝入乙醇69.9～373.4 mL，則有發生乙醇中毒的高風險；而當意外攝入4.74 mg的甲醇，則會造成人的中毒死亡［10］。動物鮮酒糟可引起以乙酸中毒為主的癥狀；長期大量攝入乳酸，可降低胃腸道內容物的酸度，影響微生物區系，降低消化機能和鈣的吸收。在酒糟中加入1%～1.5%碳酸氫鈉或0.1%～1%生石灰，是目前預防動物酒糟中毒的常見策略［10］，但尚未相關的試驗報道。膨潤土是一種極性吸附劑，依靠其靜電引力和熱運動的平衡作用可實現物理吸附作用，通過水合作用、離子和分子的相互作用及共價鍵和氫鍵結合等還可實現化學吸附作用［11］。氧化鎂為堿性氧化物，有吸附作用，作為反芻動物飼料的無機鎂源，近年來以飼料添加劑的形式廣泛應用于奶牛飼養中［12］。提純的腐植酸鈉呈堿性（pH值在8～11之間），有較強的吸附和螯合作用，在畜牧獸醫上主要用于動物的飼料添加劑，發揮增進食欲、提高抗病力、促進生長等作用［13］。蒙脫石的主要成分為硅鋁酸鹽，表面有大量微孔，有強力的吸附作用，具備吸附重金屬、霉菌毒素、病原菌、細菌毒素和維護胃腸道黏膜及防治腹瀉等功效，已廣泛應用于動物生產中［14］。分子篩具有豐富的孔道結構、良好的穩定性及極好的選擇性吸附作用，在環境保護、食品及化妝品加工、精細化工等方面應用廣泛［15］。氧化鈣為堿性氧化物，用其處理反芻動物粗飼料，可促進粗飼料細胞壁水解，提高消化率［16］。

本試驗選擇上述具有吸附、中和酒糟中酸類、醇類作用的物質，研究其體外拮抗酒糟中主要毒性成分的效果，結果顯示：對乙醇拮抗作用最強的是1%蒙脫石和1%氧化鈣，對乙酸拮抗作用最強的是1.5%碳酸氫鈉和1%、5%蒙脫石以及1.5%氧化鎂，對乳酸拮抗作用最強的是1.5%氧化鎂，對甲醛拮抗作用最強的有3%、5%分子篩和3%、5%氧化鈣?？偟膩砜?，對4種毒性成分綜合拮抗作用最好的是1%氧化鎂，而1%氧化鈣、1%蒙脫石也可發揮一定的拮抗作用。

4 結論

本試驗對來自川渝地區大、小白酒廠的高粱型白酒糟、啤酒糟中乙醇等9 種物質進行了測定分析，結果得出乙醇、乙酸、乳酸、甲醛的檢出量較高，按干物質計算，乙酸、乳酸及乙醇含量可達克級水平；儲存30 d 內，啤酒糟中的乙醇、乙酸、甲醛含量均呈顯著上升，大酒廠酒糟中的乙醇、乙酸含量呈顯著上升，而小酒廠鮮糟中的乙醇、乙酸、甲醛含量隨儲存時間延長而顯著下降，三類酒糟中的乳酸含量均在儲存過程中顯著下降，但均高于其他幾種物質的含量。在對酒糟主要毒性成分體外拮抗物質的篩選中，以1%氧化鎂效果最好，考慮動物攝入鎂過多的風險，結合試驗中0.5%～1%氧化鎂均可有效降低酒糟中乙醇、乙酸、乳酸、甲醛檢出量的結果，建議生產中選擇適當的氧化鎂濃度。