植物蛋白與天然雙親皂苷相互作用及對食品乳液和泡沫的穩態化研究進展

陳小威，尹文俊，馬傳國

（河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

日常生活中，許多天然及加工食品是由界面存在并主導形成的多相分散體系，如牛奶、奶油、蛋黃醬、沙拉醬和乳飲料等乳液食品以及慕斯、冰淇淋、啤酒等泡沫食品。這些多相體系因氣泡和油滴等結構單元的存在而具有高比表面積，其一系列宏觀行為（形成、穩定和功能等）很大程度上取決于兩相界面（氣-水界面、油-水界面）性質，因此這些食品被認為是“界面主導食品”。這些多相態的界面主導食品因其獨特的結構而能提供特有的質地，且因具有包埋和運載活性物質的特性而被用于開發健康食品。但是，由于高比表面積和表面自由能的存在，這些界面主導食品本質上屬于熱力學不穩定體系。

以植物原料制備的食品因在營養、綠色環保和健康方面的優勢備受消費者青睞，尤其是植物蛋白基食品，如植物肉、植物奶和植物冰淇淋等。然而，植物蛋白在構建泡沫和乳液等界面主導食品方面的能力差，且在貯存過程中易發生聚集、絮凝和分層而失穩。此外，以植物蛋白為代表的生物大分子對環境具有較高的敏感性，使其在食品工業中的應用仍然具有一定挑戰，例如酸堿度、溫度和離子強度等都會造成生物大分子構象的改變，從而導致界面不穩定甚至崩塌。以植物為主要原料制備的高穩態復雜食品（如豆漿、啤酒）更多地是通過添加小分子表面活性物質形成植物蛋白-小分子表面活性劑復合物從而提高植物蛋白基界面主導食品的穩定性。傳統的研究聚焦于用合成或半合成小分子（十二烷基硫酸鈉、吐溫和司盤等）與蛋白質實現界面主導食品的穩定。近年來，食品工業致力于探尋天然表面活性物質以替代合成及半合成類小分子表面活性劑，植物來源的天然雙親性皂苷，如皂皮皂苷（saponin，QS）、茶皂苷（tea saponin，TS）、甜菊糖苷（stevioside，STE）、甘草酸苷、田七皂苷、人參皂苷、柚皮苷等成為首選。這些皂苷分子從植物中提取獲得，具有由疏水性苷元和親水糖側鏈組成的雙親結構，不僅具有能與人工合成表面活性劑相媲美的界面活性，還有多種生物活性（降膽固醇、提高免疫力和抗氧化等）。其中，以QS為代表的天然皂苷已被美國食品藥品管理局（21 CFR 172.5）、歐洲共同體（E999）和日本、澳大利亞（FSANZ-144）、新西蘭、加拿大以及中國（FEMA-2793）批準在食品、藥品和日化品中應用。研究證明，通過天然雙親皂苷能有效地改善蛋白基泡沫和乳液等界面主導食品的穩定性，且在功能因子（姜黃素和植物甾醇等）荷載、新型植物基食品體系的構建等方面具有積極意義。本文主要概述植物蛋白與天然皂苷間存在的相互作用及其界面吸附與穩定行為，進而從分子與宏觀層面分析泡沫和乳液構建與穩定的關系，以期為植物蛋白基食品的穩態化構建以及植物基食品功能因子遞送載體的構建提供理論支撐與技術指導。

1 植物蛋白與天然雙親皂苷的相互作用

植物蛋白與天然雙親皂苷之間主要存在疏水相互作用、氫鍵以及靜電相互作用。皂苷作為非離子型小分子表面活性劑，常被認為不能解離出帶電離子而不會與蛋白質發生靜電相互作用。目前經多種技術手段（如電位和分子對接等）證實，人參皂苷Rg、Rb和Ro與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）存在靜電相互作用。李紅等通過分子對接技術發現，人參皂苷不僅與血清蛋白間發生靜電相互作用，還具有氫鍵和疏水相互作用。而大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）與STE、小麥醇溶蛋白與TS、低溫熱變性豌豆蛋白與QS均可通過疏水相互作用結合。表1總結了部分蛋白質與皂苷相互作用的研究，這些研究證實了蛋白質與皂苷間相互作用的形式不是唯一的，分子常以多種弱作用力形式相互聯結形成穩定的復合物。圖1為植物蛋白與天然雙親皂苷相互作用示意圖。多種作用力存在的情況下，體系中主要分為兩種結合形式：一種是植物蛋白直接與雙親皂苷連接，通過疏水相互作用（植物蛋白疏水空腔包裹皂苷的疏水苷元）、氫鍵相互作用（植物蛋白部分親水性氨基和皂苷親水糖側鏈結合）和靜電相互作用（所帶異性電荷相吸）結合；另一種是在外界環境的刺激下，植物蛋白內部的鍵被削弱而發生結構變化，之后再與雙親皂苷結合。結構展開的植物蛋白與皂苷產生更強的相互作用（疏水相互作用、氫鍵和靜電相互作用），使更多的皂苷與植物蛋白結合。此外，高濃度的天然植物蛋白和熱處理后的變性植物蛋白均易以蛋白-蛋白相互作用的形式存在，而皂苷在超過臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）后易形成膠束，這些分子的多形態化促使在發生相互作用（疏水、氫鍵和靜電相互作用）后可形成復雜的復合物。不同結構蛋白質可以選擇性地識別皂苷分子的羥基（如溶菌酶）或羧基（如-乳球蛋白（-lactoglobulin，-LG））部分，通過特殊的方式調節皂苷與蛋白質的相互作用，可為控制界面膜的機械性能開辟新途徑。

表1 部分蛋白質與皂苷相互作用研究Table 1 Summary of selected studies on interactions between proteins and saponins

圖1 植物蛋白與天然雙親皂苷相互作用的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of interactions between plant proteins and saponins

通過多種作用力形成的植物蛋白與天然雙親皂苷復合物，相對于單一物質而言，其結構和性質均會產生不同程度的改變。一方面，皂苷可被用于調控蛋白質的結構。僅用簡單的改性手段設計蛋白質結構來改善其功能性質已不能滿足需求，而利用皂苷和蛋白質相互作用已成為優化蛋白質結構的有效途徑。例如，在濃度低于CMC時，皂苷與蛋白質的疏水結合一般不會顯著影響蛋白質的結構，但當濃度高于CMC時，皂苷形成的膠束能使蛋白質發生明顯的去折疊；另一方面，蛋白質與皂苷的結合會促進部分功能活性的提升。Potter等通過動物實驗研究發現，向酪蛋白中添加皂苷會導致低密度脂蛋白/高密度脂蛋白比值顯著降低。

2 植物蛋白與天然雙親皂苷在界面的吸附行為

不同乳化劑界面吸附行為決定其降低界面張力的能力、形成的界面膜黏彈性、膜厚度和致密性，進而影響相關體系的宏觀性質，如乳液和泡沫的穩定性和流變學特性。因此，研究乳化劑在界面的吸附行為對穩定體系的構建十分重要。目前常采用兩個模型來模擬蛋白質吸附到界面的過程，第一個模型是Graham等提出的“環鏈模型”（圖2A）。它描述了一個多步驟過程，涉及蛋白質從體相擴散到界面，然后進行吸附和構象展開。在這種模型下，蛋白質通常被看作是柔性聚合物鏈，到達界面后疏水部分定向到氣相（鏈），親水部分延伸到水相（環），最后形成“環鏈”結構。不同的是，Wierenga等提出第二種“膠體模型”（圖2B），其認為蛋白質在界面處表現為帶電球體或多個帶電球體的組合，在吸附時保留其天然構象。外吸附層可作為帶電粒子的填充層，隨著靜電斥力的增強（表面電荷增加），外吸附層加厚，相互作用變強，球體間距變遠。在界面吸附誘導過程中，植物蛋白分子結構變化以及分子間的相互作用（靜電相互作用和空間位陰）使其在氣-水界面上形成類似凝膠的界面網絡結構的蛋白吸附膜。在油-水界面，植物蛋白分子則會重新定向排列以減少熱力學陰礙、降低界面張力，從而形成3D網絡結構。但植物蛋白到達界面速度慢、穩定界面膜剛性特征強和對環境敏感性高的特點使得泡沫和乳液形成能力差且易失穩。波蘭Wojciechowski教授團隊研究發現，通過添加天然雙親性皂苷（如七葉皂苷、TS、QS等）可解決蛋白質穩定性差的難題。這是因為皂苷分子結構和平均界面面積的差異使其能夠以頂端排列、側端排列和平鋪排列的不同方式，在分子間疏水相互作用和糖基間氫鍵作用下，于氣-水界面上形成比植物蛋白更致密的高黏彈性界面膜（圖2C）。而帶有不同苷元和糖基的皂苷分子在界面的吸附形態和相互作用程度不同，如單糖側鏈的七葉皂苷和TS，TS吸附層的疏水部分由垂直于表面并完全暴露于氣相的三萜類骨架組成；七葉皂苷由于三萜部分存在羥基使得親水結構僅部分浸入水相，疏水苷元外層在空氣中堆積不緊密。對于雙糖側鏈皂苷，當親水糖側鏈大小不一時（如人參皂苷），常導致大親水糖側鏈基團插入水相而疏水苷元與小親水糖側鏈共同趨向于疏水氣相；當親水糖側鏈大小相似時（如QS），則導致糖側鏈基團均插入水相而疏水皂苷趨向于疏水氣相。因此，天然雙親皂苷的吸附效果主要是由氫鍵作用后緊密堆積的糖側鏈基團控制。到達界面后，天然皂苷分子會定向排列并出現某種特異組裝行為，形成堅固的褶皺膜，在宏觀上表現出纖維狀、片狀、囊泡狀等組裝形貌（圖2D），如甘草酸分子自組裝形成纖維，通過多層纖絲膜（在氣-水界面）和氫鍵纖絲網絡（在氣泡表面和連續相中）穩定泡沫。當加入油相乳化形成乳液后，纖維間相互作用（氫鍵）產生的多層界面結構能有效抗絮凝和聚結。本課題組前期研究證實，QS同樣能在油-水界面上自組裝，通過皂苷分子間π-π堆積和氫鍵結合螺旋扭曲形成納米纖維組裝體，在分散油滴表面形成多層膜，提高乳液穩定性。與植物蛋白不同的是，當皂苷達到一定濃度且體系中油相含量比較高時，這些結構單元才能自組裝形成3D網絡結構，使乳滴固定，進而構建成乳液凝膠。

圖2 蛋白在界面的吸附機制和皂苷在界面的吸附行為[23-24,28,32]Fig. 2 Adsorption mechanism of proteins at the interface and adsorption behavior of saponins at the interface[23-24,28,32]

植物蛋白與天然雙親皂苷在穩定油-水或氣-水界面時均可以吸附到界面上并能降低界面張力，但二者降低界面張力的能力和效率以及對吸附層的穩定特性并不相同。目前的研究將蛋白質與小分子共存時的界面吸附機制分為3 種（圖3）：協同作用、競爭吸附和分子置換。早期英國著名的膠體界面化學家Dickinson教授對乳蛋白-小分子表面活性劑混合體系的吸附特性進行了大量的研究和總結，認為蛋白質-小分子表面活性劑復合體系界面吸附行為更傾向于通過置換機理實現。具體而言，對于已形成的植物蛋白界面，當添加的小分子表面活性劑濃度達到一定量時，可將蛋白從界面上完全置換，最后形成小分子的特征界面膜。隨著合成和半合成表面活性劑廣泛的應用，學者們對蛋白質與十二烷基硫酸鈉、吐溫系列和司盤系列等合成和半合成小分子表面活性劑進行研究，通過界面張力和界面流變學行為對吸附過程進行表征，發現具有大親水基團的吐溫系列（如吐溫20）在低濃度下易通過競爭吸附將蛋白質置換，而對于一些小親水基團的非離子表面活性劑（如司盤80），在達到一定濃度后其與蛋白競爭的效果才顯著。對于植物蛋白而言，其與天然雙親皂苷被認為主要是通過協同作用穩定界面。當植物蛋白與天然皂苷共同加入水相時，在較低皂苷濃度下，體系的界面吸附、擴張流變學行為是由蛋白主導；達到適宜皂苷濃度時，植物蛋白與天然皂苷分子通過非特異性疏水相互作用和氫鍵等發生弱的結合（圖1），誘導蛋白分子部分解離及剛性結構松散，表現出獨特的降低界面張力的協同性及穩態的界面彈性行為，此時的復合界面層具有一定剛性和柔性，能更好地響應外部壓力，從而提高泡沫和乳液的穩定性；當大量皂苷存在時，體相中形成大量皂苷膠束，皂苷會先于蛋白-皂苷膠束復合體吸附到界面而形成主要由皂苷覆蓋的弱表面層結構，此狀態下的體系穩定性較弱，但皂苷形成膠束會使蛋白質發生去折疊，隨著吸附時間的延長可形成更為穩定的界面膜。這樣的植物蛋白與天然雙親皂苷協同穩定界面機制已被許多學者證明。

圖3 植物蛋白與天然雙親皂苷的界面吸附機制示意圖[39,42]Fig. 3 Schematic diagram of interfacial adsorption mechanism between plant proteins and saponins[39,42]

3 植物蛋白與天然雙親皂苷對泡沫和乳液的穩態化

為了更好地分析相互作用和界面吸附行為在界面主導食品形成能力和穩態化中的作用，需理解乳液和泡沫的多尺度結構特征。乳液和泡沫在不同尺度上具有不同的結構水平，如圖4所示，從分子水平的體相行為、界面膜到宏觀層面的乳滴與氣泡以及最終的乳液和泡沫體系。食品是一種公認的軟凝聚態物質，具有多組分、多相態、多結構尺度等屬性。食品的功能特性是由食品多組分（蛋白質、碳水化合物、油脂及生物小分子）相互作用及由此形成的多相態（水相、油相、凝膠相）、多尺度（納米、微米、毫米及厘米）結構決定的。在特定界面主導食品加工條件下，食品多組分可在三維體相通過分子間相互作用及自組裝形成納/微米尺度結構體，這些結構單元可在油-水、氣-水等二維流體界面上經界面組裝、界面交聯等形成油滴、氣泡等而最終裝配成乳液、泡沫等宏觀食品體系，從而決定食品的品質（穩定性、風味、顏色）、營養及功能性（營養素輸送、飽和/反式脂肪替代）。由此可見，作為連接食品體系分子行為與宏觀性質的橋梁，食品組分間的相互作用及納微結構單元的設計與構建及其二維流體界面行為控制對于控制最終食品的品質與營養起到極為關鍵的作用。

圖4 乳液（A）和泡沫（B）結構的多尺度特征示意圖Fig. 4 Multi-scale characteristics of emulsion (A) and foam (B) structures

皂苷分子的添加可賦予植物蛋白基泡沫高黏彈性和穩定性。B?ttcher等利用熒光技術和界面流變學等證實了-LG和QS可形成黏彈性界面網絡，使體系具有高剪切和膨脹模量，進而提高泡沫穩定性和抗外力刺激能力。-LG和QS在體相中通過氫鍵、范德華力或疏水相互作用，以1.7 個結合位點數形成復合物，在氣-水界面上形成多形態分子穩定的界面層，提高了泡沫的穩定性。值得注意的是，復合物實際吸附到界面上的量較少（界面張力增加）時會發生部分解吸，促使體相中的-LG和QS到達空缺界面而呈現競爭吸附。在適宜QS濃度下，-LG和QS可通過協同作用提高剪切黏彈性、液膜厚度和液體含量，實現泡沫的長期穩定。這樣的協同效應在大豆11S蛋白和7S蛋白與大豆皂苷復合體系的起泡性和泡沫穩定性研究中也被證實。這些研究表明植物蛋白-天然皂苷基泡沫的穩態化機制會隨著表面活性劑濃度的變化而調整。具體地，植物蛋白-皂苷復合體系可保留分子自身穩定泡沫的規律，但是皂苷的添加通過競爭吸附破壞植物蛋白吸附層，該情況下皂苷不再通過吉布斯-馬朗戈尼機制維持界面，這使得復合體系界面張力不易平衡，泡沫的穩定性變弱。隨著皂苷濃度的增加，它會逐漸代替界面上的蛋白分子，皂苷的強分子間相互作用使分子自排序而形成結構域，提高界面層的膨脹和剪切模量，因此泡沫體系的穩定性得到提高。當皂苷濃度一定時，植物蛋白與皂苷協同作用使界面表現出顯著的強相互作用、低界面張力和高界面膨脹模量，從而實現泡沫穩定。同樣地，添加皂苷在提高植物蛋白基乳液貯藏穩定性、氧化穩定性、環境穩定性等方面均效果顯著（表2）。這樣的穩定效果均歸因于分子間發生相互作用，皂苷可改變植物蛋白的剛性結構，進而有效降低界面張力，形成具有高柔韌性的界面層。乳液的穩定機制和穩定性過程與泡沫體系類似。此外，通過熒光技術和界面流變學等分析結果能反映分子結合程度和界面組成的變化，為皂苷分子與蛋白質在體相中和界面上的作用過程提供關鍵信息，對穩定機制做出解釋。

表2 蛋白質-皂苷復合穩定乳液Table 2 Emulsions stabilized by a synergistic interaction of proteins and saponins

4 結 語

通過添加天然雙親皂苷分子可改善植物蛋白基乳液和泡沫類界面主導食品的穩定性，但植物蛋白與皂苷分子在這些體系中的具體穩定機理相對復雜。研究證明，植物蛋白和天然皂苷在體相中和界面上主要以疏水相互作用、氫鍵和靜電相互作用實現分子間緊密結合，但是不同分子吸附行為的差異和相互作用下分子形態的多樣化使得它們能以協同作用、競爭吸附和分子置換等吸附機制穩定界面，最終實現泡沫和乳液等界面主導食品的穩態化。然而，在穩定機理的探究過程中仍存在疑點，如微觀結構與宏觀表現間的構效關系尚未明確。通過結合耗散型石英晶體微天平、界面流變和朗繆爾（Langmuir）膜天平等新技術進一步揭示植物蛋白與天然雙親皂苷在泡沫和乳液等界面主導食品中的穩態化規律以及在多尺度結構上的構效關系可能是該研究領域的一個突破點。作為多相態的體系，植物蛋白-天然雙親皂苷穩定的泡沫和乳液在食品功能因子遞送方面存在天然的優勢，然而目前該方面的相關研究較少。此外，雙親皂苷對蛋白基食品在口感、營養和安全方面的影響也應該被重視。