牛蒡子苷元對四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠肝損傷的保護作用

由高飛，唐金鑫，孫 航，劉士偉，李秋陽，徐 萍，于 雷，畢云楓

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118）

據2019年臨床數據統計，我國患糖尿病（diabetes，DM）人數約為1.16億 人，占總人口的12.8%，隨著人們生活水平的改善和不健康飲食習慣的增加，DM患者已經出現早期患病、低齡患病人數增加的趨勢。DM患者血糖長期處于較高水平，從而可引發各種并發癥，如肝臟、腎臟、血管和心臟相關疾病等，其中肝臟病變率高達21%～78%。當前DM型肝病患者治療以終身用藥為主，不能達到根治，且長期服藥會產生多種毒副作用，導致體質量下降。因此尋找高效、低毒的具有保護DM肝臟損傷的天然活性成分已成為當前人們關注的焦點。

牛蒡子是菊科草本作物牛蒡的干燥果實，牛蒡子苷元（arctigenin，ATG）是牛蒡子中的木質素類成分（質量分數為0.5%～1.0%），可通過酶解或酸水解牛蒡子苷（質量分數5%～7%）制備，ATG可在動物腸道內高效發揮藥理作用，研究發現ATG具有抗流感病毒、抗結腸炎、抗DM小鼠腎臟損傷、抗抑郁和抗焦慮、降血壓和改善認知障礙等作用，其廣泛的藥理活性受到研究者的重視。目前鮮見ATG對DM肝損傷的治療效果研究，因此，本實驗研究ATG對四氧嘧啶誘導的DM小鼠肝臟損傷的保護作用，旨在為DM型肝損傷的預防、治療和ATG相關保健產品的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級ICR雄性小鼠，80 只、5 周齡，體質量25～30 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司（生產許可證號：SCXK（京）2019-0008）。

嗜熱-葡萄糖苷酶由本團隊構建的工程菌表達并提取制備；牛蒡子苷（純度為70%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；ATG（純度為97.2%）由嗜熱-葡萄糖苷酶酶解牛蒡子苷制備。

二甲雙胍（metformin，Met）、四氧嘧啶、羧甲基纖維素鈉、組織Toll樣受體4（toll-like receptors，TLR4）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、核因子κB p65（nuclear factor κB p65，NF-κB p65）單抗 北京索萊寶科技有限公司；谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（asparate aminotransferase，AST）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）試劑盒 南京建成生物研究所；所用其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JY92-IIDN型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司；2100型可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；LC-MSH-2L型恒溫加熱磁力攪拌器、Neofuge 23R型臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機有限公司；XL30 ESEM-FEG場發射環境掃描電子顯微鏡美國FEI公司；Multiskan FC型酶標儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；EA-12型安穩血糖測定儀 三諾生物傳感股份有限公司；Flexar型高效液相色譜儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 ATG的酶解制備

利用超聲波輔助-葡萄糖苷酶酶解牛蒡子苷制備ATG，根據前期實驗結果確定最佳工藝參數為酶用量質量分數3.0%、酶解時間2.5 h、酶解溫度60 ℃、超聲功率320 W。反應結束后，ATG粗提物經萃取、真空抽濾、脫色、旋轉蒸發、水洗去糖、體積分數50%乙醇溶液重結晶處理，真空冷凍干燥收集ATG提取物，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測純度為97.2%，0～4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 動物飼養

吉林農業大學動物中心第四飼養室，早8∶00至晚8∶00給予光照，溫度為23 ℃，相對濕度55%，每籠5 只小鼠，及時添加飼料和水，更換墊料，小鼠采購后適應新環境14 d。實驗倫理審查編號：20201110001。

1.3.3 實驗相關溶液的配制

溶液配制參考文獻[17]中的方法，四氧嘧啶的配制：依據小鼠每千克體質量稱取180 mg四氧嘧啶溶于0.3 mL冷生理鹽水（0～4 ℃），現用現配，2 min注射完畢；質量分數0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制：準確稱取0.300 0 g羧甲基纖維素鈉溶于60 mL蒸餾水中，磁力攪拌過夜，錫箔紙包裹，4 ℃冰箱保存備用；Met溶液配制：依據小鼠每千克體質量稱取200 mg Met，快速溶于冷生理鹽水（0～4 ℃），配制成0.3 mL溶液，混勻；ATG溶液配制：依據各組小鼠每千克體質量相應稱取120、90、60 mg ATG，加入質量分數0.5%羧甲基纖維素鈉中制成0.3 mL混懸液。

1.3.4 建立四氧嘧啶誘發DM小鼠模型

將適應14 d的小鼠晚10∶00至次日早8∶00斷食不斷水，腹腔注射180 mg/kg四氧嘧啶，給藥3 d后，前一晚斷食不斷水8 h后，尾尖取血，用血糖儀測血糖濃度，血糖濃度高于11.1 mmol/L作為DM建模標準。選取健康小鼠作為對照組，將DM小鼠隨機分組，灌胃給藥：對照組、模型組灌胃生理鹽水10 mL/kg，Met組灌胃Met 200 mg/kg，ATG高、中、低劑量組分別灌胃120、90、60 mg/kgATG，各給藥溶液均為給藥前配制，每日早8∶00給藥，實驗周期為28 d。

1.3.5 常規指標測定

第一次灌胃給藥后，每7 d記錄小鼠體質量和空腹血糖濃度，觀察各組小鼠健康狀態。實驗結束稱量各組小鼠肝質量，根據下式計算肝臟指數。

1.3.6 血清指標測定

灌胃4 周，最后一次灌胃后，將所有小鼠轉移至解剖室進行樣品的采集，眼球取血1 mL，使血液緩緩自然流下，常溫靜置1 h，冷凍離心機分離血清（5 000 r/min、10 min），于-20 ℃冰箱備用。按照試劑盒說明書測定ALT、AST活力和IL-6、TNF-α質量濃度。

1.3.7 GSH、CAT、SOD水平測定

將小鼠脫頸椎處死，解剖分離肝臟組織，生理鹽水沖洗肝臟表面血跡，稱質量、記錄，各組取0.200 0 g肝組織，剪刀剪碎后，超聲波細胞粉碎機進行冰水浴粉碎，加入適量冷生理鹽水，配制質量分數5%的組織勻漿液，冷凍離心（5 000 r/min、10 min）得上清液。依據說明書中小鼠肝勻漿濃度曲線進行預實驗，確定最佳的組織樣品濃度，按照試劑盒說明書測定GSH、CAT、SOD水平。

1.3.8 肝臟組織病理學分析

取相同部位肝組織，經質量分數4%甲醛溶液固定，脫水、透明處理、包埋后，制備3 μm切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）法染色，于電子顯微鏡下（400 倍）觀察小鼠肝組織病理變化。

1.3.9 蛋白免疫印跡分析

將肝組織冰浴迅速剪碎，倒入蛋白裂解液快速研磨10 min，低溫離心（6 000 r/min、20 min）后測定蛋白含量，經過配膠、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、轉移、轉膜后，充分將樣品中相關蛋白條帶分離。洗膜：用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）處理5 min，重復3 次（下同）；加入包被液，緩慢搖晃，室溫放置2 h，倒掉包被液，再次洗膜；一抗：用0.01 mol/L PBS稀釋，覆蓋聚偏二氟乙烯膜，室溫放置2 h。用1%牛血清白蛋白（質量分數98%）作對照；二抗：加入辣根過氧化物酶偶聯，緩慢搖晃，室溫放置2 h；倒掉二抗，洗膜；暗光加顯色劑，待出現條帶，加入雙蒸水停止反應。用ImageJ軟件進行灰度分析，結果以目的蛋白相對GADPH的表達量表示。

1.4 數據處理與分析

數據表示為平均值±標準差，每組重復3 次，使用Origin Pro 9.0軟件作圖和SPSS 26軟件分析數據，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較分析采用Bonferroni法。以＜0.05、＜0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2 結果與分析

2.1 建模情況分析

四氧嘧啶腹腔注射劑量為180 mg/kg，對于第一次建模未成功小鼠進行第二次半數劑量建模（90 mg/kg），建模成功率為62%。建模后，6 只小鼠死亡，死亡原因有小鼠機體免疫力低下、DM引起的不適和小鼠相互撕咬等，與灌胃ATG無關。小鼠DM癥狀明顯，表現為體毛變得粗糙雜亂、伏地行走、不好動、反應遲緩、墊料潮濕、糞便較多和飲食進水量增加等。

2.2 小鼠常規指標分析結果

空腹血糖濃度能夠準確反映出DM小鼠患病狀況，由圖1可知，與對照組相比，模型組小鼠血糖濃度極顯著升高（＜0.01），均超過11.1 mmol/L，結合2.1節小鼠生理狀況，證明本實驗DM小鼠模型建立成功。在28 d時，與模型組相比，Met組、ATG高劑量組小鼠血糖濃度極顯著下降（＜0.01），相比于0 d時，血糖濃度分別降低30.75%、26.12%。

圖1 ATG對小鼠血糖濃度的影響（n＝7）Fig. 1 Effect of ATG on the blood glucose level of mice (n = 7)

由表1可知，與0 d相比，28 d時各組小鼠體質量都有不同程度的增長，對照組、Met組和ATG高劑量組小鼠體質量極顯著增長（＜0.01），分別增長20.22%、13.47%和11.03%；模型組小鼠體質量增長不顯著（＞0.05）。0～7 d時，部分小鼠因注射四氧嘧啶后，機體代謝發生紊亂，體質量會出現負增長，而Met、ATG不同劑量組都能對DM小鼠體質量的下降起到改善作用。

表1 ATG對小鼠體質量的影響（n＝7）Table 1 Effect of ATG on body mass of mice (n = 7)g

如表2所示，與模型組相比，ATG高、中劑量組對肝臟指數作用效果極顯著（＜0.01），低劑量組作用效果不顯著（＞0.05）。綜上所述，ATG可以改善DM小鼠體質量降低、肝臟脂肪堆積的情況，ATG高劑量組與Met組治療效果相當。

表2 ATG對小鼠肝質量和肝臟指數的影響（n＝7）Table 2 Effect of ATG on liver mass and liver index of mice (n = 7)

2.3 血清指標分析結果

AST和ALT是反映肝臟健康程度的指標，小鼠肝臟在受到藥物刺激時，器官內的AST和ALT會通過受損的器官流向組織間隙，進入血液。由圖2可知，與對照組相比，模型組ALT活力和AST活力極顯著升高（＜0.01），表明DM小鼠的肝器官受到了損傷。與模型組比較，Met組、ATG高劑量組的ALT活力和AST活力均極顯著降低（＜0.01）；ATG中劑量組AST活力顯著降低（＜0.05），ALT活力無顯著變化（＞0.05）。以上結果說明，ATG治療可改善DM小鼠血清中ALT活力和AST活力。

圖2 ATG對小鼠血清AST（A）、ALT（B）活力的影響（n＝7）Fig. 2 Effect of ATG on the activities of AST (A) and ALT (B) in serum of mice (n = 7)

IL-6、TNF-α是引起肝臟炎癥的重要促炎因子，通過檢測血清中IL-6、TNF-α的水平可以判斷肝臟的炎癥程度。ATG對DM小鼠肝臟炎癥因子IL-6、TNF-α質量濃度的影響如表3所示，相比于對照組，模型組中IL-6、TNF-α質量濃度極顯著升高（＜0.01），表明本實驗DM小鼠已經出現炎癥變化。與模型組比較，Met、ATG所有劑量組IL-6、TNF-α質量濃度均顯著降低（＜0.01、＜0.05）。以上結果說明ATG灌胃干預后，可減輕DM小鼠肝臟內炎癥反應。

表3 ATG對小鼠肝組織IL-6、TNF-α質量濃度的影響（n＝7）Table 3 Effect of ATG on the contents of IL-6 and TNF-α in liver tissue of mice (n = 7)

2.4 肝臟勻漿相關指標分析結果

GSH、CAT和SOD水平是評價機體內氧化應激反應的重要指標，能在一定程度反映機體受到外界刺激后體內氧化還原平衡的改善能力。如圖3所示，與對照組相比，模型組中GSH含量、CAT活力和SOD活力均出現極顯著下降（＜0.01）。與模型組比較，ATG高劑量組中GSH含量、CAT活力和SOD活力不同程度的升高（＜0.01、＜0.05），且對于CAT活力的改善效果與陽性Met組相當，ATG中劑量組CAT活力和SOD活力顯著升高（＜0.05）。以上結果表明，ATG對DM小鼠肝臟化應激起到改善作用，能夠使GSH含量、CAT活力和SOD活力趨近于正常值，從而改善DM小鼠肝臟氧化應激水平。

圖3 ATG對小鼠肝組織GSH含量（A）和CAT（B）、SOD（C）活力的影響（n＝7）Fig. 3 Effect of ATG on the levels of GSH (A), CAT (B) and SOD (C)in liver tissue of mice (n = 7)

2.5 肝臟組織病理切片觀察結果

如圖4所示，對照組肝組織形態完整清晰，不存在脂肪變性現象，組織細胞被正常紅染，細胞均勻，內部漿液清晰可見，中間藍色為細胞核；模型組小鼠肝臟則表現異常，排列明顯疏松不規則，細胞內顯示出空泡形態，且有出血現象，說明脂肪已經變性；ATG高、中劑量和Met對肝臟組織損傷有一定的改善作用，細胞內染紅面積增大，細胞空泡和出血區域減少；ATG低劑量組肝臟切片區域形態基本與模型組無差異，無明顯改善效果。

圖4 ATG對小鼠肝組織病理變化的影響Fig. 4 Effect of ATG on histopathological changes of liver tissue in mice

2.6 蛋白免疫分析結果

DM小鼠肝臟中TLR4、MyD88和NF-κB p65電泳表達量和蛋白相對表達量分別如圖5、6所示，與對照組相比，模型組中TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相對表達量極顯著升高（＜0.01），ATG高劑量組和Met組有相似的治療效果，均可顯著降低TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相對表達量（＜0.01、＜0.05）；ATG中劑量組干預效果不顯著（＞0.05）；ATG低劑量組中MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量顯著降低（＜0.01、＜0.05），但對TLR4蛋白表達無顯著降低作用（＞0.05）。以上結果表明，ATG對于DM小鼠肝損傷有一定的治療作用，且與TLR4、MyD88和NF-κB p65信號通路有密切聯系。

圖5 TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白電泳圖Fig. 5 Electrophoresis profiles of TLR4, MyD88 and NF-κB p65 proteins

圖6 ATG對TLR4（A）、MyD88（B）、NF-κB p65（C）蛋白相對表達量的影響Fig. 6 Effect of ATG on the relative expression levels of TLR4 (A),MyD88 (B) and NF-κB p65 (C) proteins

3 討 論

ATG是牛蒡子中主要的活性成分之一，其在改善DM及其并發癥方面具有廣泛作用，研究發現ATG可抑制-葡萄糖苷酶活力，延緩血糖濃度增高，從而達到調節血糖水平的作用，ATG給藥后，DM小鼠的尿蛋白量、TNF-α表達量下降，蛋白質的非酶糖化能力受到限制，證實ATG可減輕DM腎病損傷。馮芹等發現ATG可降低DM大鼠血壓，增加血管內皮生長因子的表達，改善血小板參數特征，減少血小板的破壞，并可降低白細胞總數，改善DM慢性炎癥。基于以上研究結果，本實驗表明，ATG能降低DM小鼠血糖濃度、提高其體質量，且能降低炎癥因子TNF-α、IL-6的質量濃度。

肝臟損傷是DM最常發生的器官損害之一，肝臟損傷病理過程比較復雜，且可能與體內炎癥因子表達、水平改變有關，目前研究的主要發病機理是通過脂質過氧化產物指標表示氧化應激，如丙二醛、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量。氧化應激在1型和2型DM的高血糖癥中已有報道，因此被認為是DM并發癥發展的中心因素；經四氧嘧啶、CCl、脂多糖等誘導的小鼠機體內的氧化應激水平會發生改變，而過度的氧化應激反應會促進相關炎癥因子的釋放，如TNF-α和IL-1β，而TNF-α與NF-κB通路的表達有緊密聯系，前者可活化肝臟內中性粒細胞使氧自由基外流，進而正反饋激活NF-κB，從而使氧化應激和炎癥反應形成循環通路，對肝臟細胞造成損傷；TLR4是NF-κB信號通路中主要表達因子，TRL4信號通路被激活后，從而影響NF-κB通路，激活多種炎性因子表達，發生炎性反應，進而會導致機體組織、器官的損傷。研究發現，脂質過氧化可改變氧化應激水平，從而引起細胞損傷。陳羨人等發現人參皂苷Rg1可明顯降低大鼠肝組織TLR4蛋白陽性細胞占比，提高SOD、CAT、GSH-Px活力以及總抗氧化能力，并改善大鼠肝組織結構形態。張韞等發現黃連素可改善2型DM大鼠肝臟氧化損傷，大鼠肝組織的Nrf2、SOD、CAT、GSH-Px等表達量明顯升高，該過程可能是通過Nrf2介導的抗氧化實現的。因此，DM肝損傷可能由于TLR4、MyD88、NF-κB p65誘導的炎性通路被激活，引起下游TNF-α、IL-6等炎癥因子表達，進而對氧化應激水平產生影響，加劇炎癥發展，引起更嚴重的組織損傷。

4 結 論

本研究發現ATG給藥處理后，與模型組相比，ATG高劑量極顯著降低了DM小鼠血清中ALT活力和AST活力（＜0.01）；ATG高、中劑量極顯著降低了炎癥因子IL-6、TNF-α質量濃度（＜0.01）；ATG高劑量極顯著提高了糖尿病小鼠肝臟內CAT、SOD活力（＜0.01），顯著提高GSH含量（＜0.05）；ATG高劑量顯著降低肝臟內TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相對表達量（＜0.05、＜0.01），以上結果表明ATG干預后DM小鼠氧化應激和炎癥因子水平均得到改善，肝臟損傷癥狀減輕，但其作用機理仍需進一步闡明。由于對DM肝臟損傷仍缺乏有效的治療手段，因此探討ATG對DM肝臟損傷的保護作用對開展臨床DM肝損傷研究具有重要意義。