小麥肽改善慢性疲勞綜合征大鼠認知功能障礙

劉 輝，周安妮，胡勝男，陳 寧，秦 智，賈紹輝,*

（1.武漢體育學院健康科學學院，運動訓練監控湖北省重點實驗室，天久運動營養食品研發中心，湖北 武漢 430079；2.武漢體育學院研究生院，湖北 武漢 430079）

慢性疲勞綜合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是一種至少持續6 個月，以嚴重身體和腦疲勞為主要表現的綜合征候群，常伴隨睡眠障礙、短期記憶力減退、注意力下降、頭痛、關節痛等癥狀。與一般性疲勞有所區別的是，充分休息并不能很好緩解CFS患者的臨床癥狀，且目前尚無針性的CFS標準治療方法，常用治療手段主要包括增強免疫能力的藥物治療，營養平衡療法，改善認知行為的治療、局部物理治療以及分級運動療法等。已有研究表明CFS患者普遍存在認知功能障礙，因此靶向改善認知功能障礙的治療方法被認為有助于緩解CFS癥狀。

最近的研究結果提示合適的營養補充可能是CFS的有效干預手段。小麥肽是利用現代酶解技術酶解小麥蛋白而獲得的一種小分子混合肽，諸多研究證實小麥肽具有良好抗氧化、免疫調節以及促進損傷恢復等多種生物學功能。此外，氧化應激的增加和免疫功能低下是誘導CFS發病的兩大重要原因，據此推測小麥肽可能具有緩解CFS臨床癥狀的功效。鑒于認知功能障礙是CFS患者常見的臨床表現，本實驗通過構建CFS大鼠模型，分別口服給予低、中、高劑量小麥肽進行干預，考察小麥肽對CFS模型大鼠認知功能障礙的改善作用，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥肽由山東中食都慶生物技術有限公司制備并提供。

70 只健康雄性SD大鼠購自湖北省三峽大學動物實驗中心，生產許可證號：SCXK（鄂）2011-0012，體質量180～220 g。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 北京索萊寶生物技術公司；色氨酸、5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、腦源性神經營養因子（brainderived neurotropic factor，BDNF）以及神經生長因子（nerve growth factor，NGF）酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）、IL-10、腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor β，TNF-β）以及干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF） 上海碧云天生物技術公司。

1.2 儀器與設備

LA8900氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；Morris水迷宮（ZS-Morris） 北京眾實迪創科技發展有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥肽分子質量和氨基酸組成測定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）測定小麥肽分子質量，采用氨基酸分析儀測定小麥肽氨基酸組成，每種氨基酸含量表示為其在總氨基酸含量中的占比。

1.3.2 實驗動物及分組

大鼠適應性喂養1 周后，隨機選擇10 只大鼠作為正常對照組（N），其余實驗大鼠進行CFS造模。造模成功后，將模型大鼠隨機分為模型對照組（M）、低劑量小麥肽組（M+L）、中劑量小麥肽組（M+M）以及高劑量小麥肽組（M+H），每組10 只。M+L、M+M以及M+H組實驗大鼠分別灌胃給予0.2、0.4、0.8 g/（kg·d）小麥肽，N組與M組大鼠灌胃同等劑量的生理鹽水，每天1 次，共8 周。干預結束后，水迷宮實驗用于評估大鼠認知功能；水迷宮實驗結束后，處死大鼠取外周血，4 ℃、3 000 r/min離心5 min收集血清，采用ELISA法試劑盒檢測色氨酸、NGF、BDNF、IL-4、IL-10、TNF-β以及IFN-γ濃度，同時收集實驗大鼠新鮮海馬組織用于測定SOD活力、MDA和5-HT含量。

1.3.3 CFS模型大鼠構建

采用慢性束縛結合冷水力竭游泳的方式構建CFS大鼠模型。將實驗大鼠放入圓柱形塑料筒（筒長18 cm、直徑7 cm，前端有一內徑為1.5 cm漏斗樣通氣口）中進行束縛以限制其活動，束縛時間30 min，然后將大鼠轉移至游泳缸內進行游泳干預至力竭，力竭判斷以頭部沉入水中3 s不浮出水面為標準，水溫維持18～22 ℃。每天進行1 次上述干預，實驗大鼠出現體質量明顯減輕、毛發稀疏泛黃、背部皮膚松弛、大便干結或稀溏、精神萎靡不振、活動減少以及食欲下降等現象時，認定模型構建成功。

1.3.4 認知功能評估

采用Morris迷宮評估實驗大鼠認知功能。干預結束前6 d進行適應性訓練，訓練前先在水池壁標記4 個入水點，將水池劃分為4 個象限。然后分別進行定位航行實驗和空間探索實驗。

定位航行實驗：實驗前1 d，讓大鼠在水池內自由游泳120 s以熟悉環境，實驗開始后每天進行5 次訓練，依次從4 個象限入水點處面向池壁將大鼠放入池中，記錄大鼠爬上平臺所用時間，即逃避潛伏期，如果大鼠在120 s內未能爬上平臺，則將其引導至平臺，并將逃避潛伏期記錄為120 s，2 次訓練之間休息60 s，共訓練5 d。

空間探索實驗：定位航行實驗結束后，將平臺撤除，從第Ⅲ象限入水點處將大鼠放入水中，記錄120 s內大鼠穿越平臺位置的次數以及在平臺象限逗留的時間。

1.3.5 海馬組織SOD活力和MDA含量檢測

取實驗大鼠海馬組織40 mg，加入細胞裂解液1 mL、蛋白酶抑制劑PMSF 1 μg，4 ℃下采用組織勻漿機勻漿5 min，然后冰浴超聲2 min。處理完畢后樣品于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用相應試劑盒測定海馬組織中SOD活力和MDA含量。

1.3.6 炎性因子與神經細胞因子水平檢測

取1.3.2節收集的實驗大鼠血清，采用ELISA試劑盒檢測血清色氨酸、NGF、BDNF、TNF-β、IFN-γ、IL-10以及IL-4含量。另取1.3.5節制備的適量海馬組織上清液，采用ELISA檢測試劑盒檢測其中5-HT含量。

1.4 數據處理與分析

實驗結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 2.4軟件對數據進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小麥肽分子質量分布

GPC檢測結果（表1）表明，小麥肽中分子質量小于1 003 Da的肽占比97.52%，分子質量小于505 Da的肽占比91.05%，分子質量小于270 Da的小肽占比66.28%。

表1 小麥肽分子質量分布Table 1 Molecular mass distribution of wheat peptide

2.2 小麥肽氨基酸組成

氨基酸測序結果（表2）表明，該小麥肽氨基酸總含量為91.98%；小麥肽中含量最高的氨基酸為谷氨酸（Glu），約為34.55%，其次為脯氨酸（Pro），約為10.79%；此外該混合肽中，支鏈氨基酸（Val、Ile和Leu）含量為14.04%。

表2 小麥肽氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of wheat peptide

2.3 小麥肽對CFS大鼠逃避潛伏期時間的影響

如表3所示，隨著訓練天數逐漸增加，各實驗組大鼠逃避潛伏期時間均呈縮短趨勢，且相同訓練時間下，CFS模型組實驗大鼠逃避潛伏期時間均顯著長于正常對照組（＜0.05），經8 周小麥肽干預后，各干預組大鼠的逃避潛伏期時間較CFS模型大鼠均顯著縮短（＜0.05），且呈一定的劑量依賴性，但各劑量組間無明顯差異。

表3 小麥肽對CFS大鼠逃避潛伏期的影響Table 3 Effect of wheat peptide on escape latency of CFS rats

2.4 小麥肽對CFS大鼠空間探索能力的影響

如表4可知，CFS模型大鼠（M組）穿越平臺象限次數與平臺象限停留時間較正常對照（N）組均顯著減小（＜0.05）。經過8 周口服小麥肽干預后，M+L、M+M及M+H組實驗大鼠穿越平臺象限次數及平臺象限停留時間較CFS模型大鼠均顯著增加（＜0.05），雖平臺象限停留時間的延長呈一定的劑量依賴性，但組間無明顯差異。

表4 小麥肽對CFS大鼠穿越平臺象限次數與平臺象限停留時間的影響（n＝10）Table 4 Effect of wheat peptide on spatial exploration capacity of CFS rats (n = 10)

2.5 小麥肽對CFS大鼠神經細胞因子分泌的影響

上述實驗結果表明，口服小麥肽可顯著改善CFS大鼠認知能力，因此進一步評估各實驗組大鼠神經細胞因子水平。如圖1所示，與正常對照組相比，CFS大鼠外周血中BDNF和NGF質量濃度顯著降低（＜0.05），而外周血中色氨酸濃度以及海馬組織中5-HT含量則顯著上升（＜0.05），經8 周口服小麥肽干預后，CFS大鼠血清中色氨酸和海馬組織中5-HT水平均顯著下降（＜0.05），外周血中BDNF和NGF質量濃度顯著升高（＜0.05），但3 種劑量小麥肽干預組間無顯著差異。

圖1 小麥肽對CFS大鼠血清中神經細胞因子分泌的影響（n＝10）Fig. 1 Effect of wheat peptide on serum neurocytokines in CFS rats (n = 10)

2.6 小麥肽對CFS大鼠海馬組織中氧化應激水平的影響

抗氧化應激能力下降是CFS發病的重要原因，本實驗進一步考察口服小麥肽對CFS大鼠氧化應激水平的影響。如圖2所示，CFS模型大鼠血清中SOD活力較正常對照組大鼠顯著降低（＜0.05），而口服給予低、中、高劑量小麥肽均能顯著增加CFS大鼠海馬組織中SOD活力（＜0.05），且呈一定劑量依賴性，但無顯著差異。同樣，M組大鼠海馬組織中MDA濃度顯著高于N組（＜0.05），而M+L、M+M及M+H組實驗大鼠海馬組織中MDA濃度顯著低于M組（＜0.05），但這3 組間比較無顯著差異。

圖2 小麥肽對CFS大鼠氧化應激水平的影響（n＝10）Fig. 2 Effect of wheat peptide on oxidative stress in CFS rats (n = 10)

2.7 小麥肽對CFS大鼠外周血中Th1型細胞因子向Th2型轉化的促進作用

對實驗大鼠血清Th1型和Th2型細胞因子水平檢測后發現，與正常對照組大鼠相比，CFS模型大鼠血清IL-4和IL-10質量濃度顯著增加（＜0.05），而TNF-β以及IFN-γ質量濃度均顯著下降（＜0.05）。經8 周口服小麥肽干預后，與M組相比，CFS大鼠血清IL-4和IL-10質量濃度均顯著下降（＜0.05）；相反，TNF-β和IFN-γ質量濃度顯著上升（＜0.05），但3 種劑量小麥肽干預組間比較無顯著差異（圖3）。

圖3 小麥肽對CFS大鼠血清中Th1型和Th2型細胞因子的影響（n＝10）Fig. 3 Effect of wheat peptide on serum levels of Th1 and Th2 cytokines in CFS rats (n = 10)

3 討 論

已有研究表明，約有一半CFS患者可受益于營養干預。飲食療法，包括飲食調整和營養補充可能有助于緩解CFS患者臨床癥狀。認知功能損傷是CFS患者常見的臨床癥狀，因此靶向改善認知功能障礙是CFS重要的臨床治療手段。本研究中，水迷宮實驗顯示CFS模型大鼠發生明顯的認知功能障礙，表現為逃避潛伏時間延長，穿越平臺象限次數和平臺象限停留時間均顯著減少；而在給予不同劑量小麥肽干預8 周后，CFS模型大鼠認知功能障礙得到明顯改善。

氧化應激是CFS的重要致病因素，過度的氧自由基毒性與CFS患者認知障礙的發生與發展密切相關。近年的研究結果顯示，疲勞患者血清中氧化參數包括MDA和活性氧水平顯著增加，而抗氧化SOD、過氧化氫酶活力以及谷胱甘肽含量則顯著降低。同樣，本研究中慢性束縛結合冷水力竭游泳誘導的CFS大鼠海馬組織中MDA濃度明顯增多，而SOD活力顯著降低，而經過8 周口服小麥肽干預后，CFS大鼠海馬組織中SOD活力顯著升高，MDA濃度大幅下降，提示小麥肽可通過降低氧化應激水平改善CFS大鼠的認知功能障礙。有研究表明，小麥肽分子質量對于其氧自由基清除能力有一定影響，分子質量越小，氧自由基清除能力越強。分子質量測定結果顯示，本研究所用小麥肽主要組分分子質量小于1 000 Da，且其中分子質量小于270 Da的小肽占比高達66.28%，這可能是本研究中小麥肽具有顯著抗氧化應激功能的主要原因。

此外，還發現CFS大鼠血清中色氨酸和海馬組織中5-HT的水平明顯升高，而神經細胞因子NGF和BDNF的含量顯著減少，口服小麥肽可有效增加血清中NGF和BDNF的含量，降低CFS大鼠血清中色氨酸濃度和腦組織中5-HT含量。5-HT是一種被廣泛研究的神經遞質，是5-HT系統的重要組成之一。已有研究表明，以色氨酸為起始的5-HT系統功能紊亂是CFS發生的重要誘導因素，CFS患者血清中色氨酸濃度顯著高于正常人群，其原因可能在于疲勞狀態下脂肪供能比例增加，造成外周血中色氨酸濃度大幅上升，而循環中色氨酸透過血腦屏障進入大腦，促進5-HT能神經元分泌5-HT，這與本研究結果一致。NGF是重要的神經營養因子，對維持膽堿能神經元的完整性和功能起著重要作用，雖然NGF在CFS中的作用還未被闡明，但諸多實驗結果已證實NGF在衰老和阿爾茨海默癥等與年齡相關的疾病中能夠促進神經元的存活和再生，有利于改善衰老或者退行性改變導致的認知功能障礙。同樣，BDNF也是一種重要的神經營養因子，研究表明外周循環中BDNF水平的下降與CFS大鼠海馬神經元凋亡和腦萎縮密切相關。本研究結果顯示，口服小麥肽可以顯著提高CFS大鼠外周循環中NGF和BDNF含量，這可能是小麥肽改善CFS大鼠認知功能的原因之一。

本研究還發現CFS大鼠血清中IL-10和IL-4質量濃度顯著高于正常對照組，而TNF-β以及INF-γ質量濃度則顯著低于正常對照組，經過8 周口服小麥肽干預后，CFS大鼠外周血中IL-10和IL-4水平顯著上升，而TNF-β和INF-γ水平顯著降低。IL-10和IL-4是典型的Th2型細胞因子，而TNF-β和INF-γ則為典型的Th1型細胞因子，結合上述研究結果認為，口服小麥肽促進CFS大鼠外周血中細胞因子由Th2型向Th1型轉變。已有研究揭示CFS患者存在細胞因子失調的現象，而細胞因子失調進一步會誘導CFS患者的免疫失調，故靶向免疫調節的治療也被認為是改善CFS癥狀的有效對策。根據相關報道，免疫失調與認知功能障礙發生密切相關，因此推測，CFS大鼠的認知功能障礙出現可能與免疫調節失衡有關，而口服小麥肽促進Th2型免疫反應向Th1型的轉變，可能是改善CFS大鼠認知障礙的一個重要原因。

值得注意的是，氨基酸測序結果揭示小麥肽中支鏈氨基酸含量較豐富，約為14.04%。已有大量研究證實支鏈氨基酸具有顯著抗氧化功能，因此認為較高含量的支鏈氨基酸可能是小麥肽降低氧自由基產生并改善CFS大鼠認知功能障礙的主要原因。同樣，氨基酸測序結果也表明小麥肽中Glu含量高達34.55%，Glu是中樞神經系統中的關鍵興奮性神經遞質，被認為對維持大腦功能至關重要，在學習和記憶形成中發揮積極作用。先前研究證實補充Glu可以顯著增加乙酰膽堿的釋放從而提高實驗大鼠的記憶力。與之相似，最近的一項研究顯示，補充Glu可以通過改善大腦的神經遞質和氧化還原系統提高實驗動物的運動能力和認知功能。另外，該小麥肽中Pro含量達到10.79%，Pro被認為與認知功能改善密切相關，有研究表明富含脯氨酸的肽對阿爾茨海默癥模型大鼠的認知功能障礙有明顯改善作用，這種改善作用可能是通過刺激免疫和神經膠質系統來實現。

綜上所述，口服小麥肽對CFS大鼠的認知障礙具有顯著改善作用，其作用機理在于減少氧化應激，調節神經細胞因子釋放以及平衡免疫失調。同時，較高含量的Glu、Pro以及支鏈氨基酸可能對該小麥肽改善CFS大鼠認知功能障礙具有重要作用。然而，在本實驗結果中，認知功能的改善與小麥肽補充并無顯著的劑量依賴性，優化的劑量還有待進一步探析；此外，本研究中缺乏市售CFS藥物作為陽性對照，因此小麥肽緩解CFS的確切療效還有待進一步驗證。