湖泊型藻類培養與致嗅物質產生的研究初探

于紅玲， 郭茜楠， 韓 旭

(天津水務集團水質監測中心， 天津 300241)

隨著水體富營養化情況的加劇，國內外很多區域報道湖泊、水庫出現了藻類爆發的情況。目前世界各國對藻類相關代謝產物的研宄已經相當廣泛和深入。藻類的次生代謝產物嗅味物質直接影響飲用水的感官性狀，引起了越來越多人的關注。20世紀50年代末至今，已有二十多個國家先后報道了水體存在異味的問題并進行了相關研究。近年來，我國各地突發飲水污染事件頻發，據調查其中很多和飲用水中藻類產生的異味相關[1]。同時，全球氣候變暖和CO2濃度的增加也為藍藻生長提供了有利條件，導致水體中藍藻大量繁殖形成藍藻水華， 影響了水域生態系統、旅游業及生態景觀。更為嚴重的是，某些有害藍藻分泌的毒素或致嗅物質會使飲用水水質惡化， 對居民飲用水安全構成威脅[2]。這其中以2-甲基異莰醇及土臭素最為常見。兩者均為萜類化合物， 20 世紀 60 年代在放線菌中被發現[3]，其嗅閾值(OTC)較低，分別為15和10 ng/L。多種藻類也能產生這兩種嗅味物質[4]。通常情況下，在藻類繁殖季節，我國部分湖泊、水庫等部分水體中的2-甲基異莰醇及土臭素濃度會超過10 ng/L，因此，進行藻類計數、土臭素和2-甲基異莰醇的檢測很重要[5]。

筆者結合近年來北方湖泊、水庫中較為常見的藻類，選擇了3種藍藻，初步摸索了藻類培養條件，在保證藻類能正常培養、傳代后，確定了藻類計數方法，搭建了致嗅物質的固相萃取-氣相色譜/質譜聯用儀快速檢測方法，對藻類培養液開展檢測，以期為進一步研究藻類與致嗅物質相關性、水中致嗅物質的去除等問題打下基礎。

1 材料與方法

1.1 培養藻類

實驗所選擇的3種藻類的信息[6]見表1。

表1 3種藻類的基本信息

1.2 儀器和試劑

人工氣候培養箱(bluepard)；生物顯微鏡(Olympus BX51)；氣相色譜/質譜聯用儀( GC-MS；Agilent 8890-5977A)，具備CTC自動進樣器固相微萃取模塊；氣相相色譜柱：DB-5MS型毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；高壓滅菌鍋。

Milli-Q 超純水，15 MΩ·cm；BG11培養基；土臭素、2-甲基異莰醇混標，100 μg/mL；2-異丁基-3-氧基吡嗪，1 000 μg/mL；氯化鈉，500 g，優級，經450℃烘烤2 h后置干燥器內備用；高純氦，純度≥99.999%；移液槍。

藻種購置于中國科學院淡水藻種庫。

1.3 人工氣候培養箱培養條件

根據初步摸索，確定藻類培養條件見表2。

1.4 藻類傳代與培養方式

1.4.1培養基配制

依據BG11培養基配制要求，進行培養基配制、分裝與高壓滅菌。

1.4.2藻種復蘇

取10 mL所購買藻種，加入10 mL BG11培養液，置于人工氣候培養箱中培養。每日鏡下觀察培養液中藻類形態，待藻類狀態正常時進行擴增培養。

1.4.3藻種傳代

用移液槍取1 mL藻類原培養液，置于100 mL新配制的BG11培養液中，混勻，放置于人工氣候培養箱培養。

1.5 致嗅物質檢測方法

1.5.1藻類培養液樣品的準備

將藻類培養液混勻，取1 000 mL容量瓶，少量純水打底，用移液槍取1 mL藻類原培養液至1000 mL容量瓶中，定容搖勻。取頂空瓶，用10.00 mL移液管從已定容的容量瓶中量取10.00 mL稀釋培養液至頂空瓶中，加入3 g氯化鈉，加入內標物(2-異丁基-3-甲氧基吡嗪，濃度40 ng/L)，立即加蓋密封，搖勻，待測。

1.5.2檢測儀器參數

頂空固相微萃取進樣條件：加熱平衡溫度，60℃；加熱平衡時間，30 min。

氣相色譜儀參考條件：進樣口溫度，250℃；進樣方式，不分流進樣；升溫程序，起始溫度60℃保持2.5 min，以8℃/min速率升至250℃，保持5 min；離子源溫度，230℃；連接線溫度，280℃；離子化能量，70 Ev；掃描模式，選擇離子檢測(SIM)，選擇離子檢測參數見表 3。

1.6 藻類計數方法

參考《內陸水域浮游植物監測技術規程》(SL 733—2016 )中密度分析要求[7]，在光學顯微鏡下計數。

2 結果與討論

2.1 藻類培養條件的確定

結合目前湖泊、水庫中藍藻繁殖季節的溫度和藍藻的生活習性，確定了藻類培養溫度為25℃，濕度為60%，光照為1 200 Lux。

每日對藻類培養液進行搖勻，以避免藻類過度聚集，影響生長。同時，應每日隨機改變藻類培養液在人工氣候培養中的位置，以保證藻類均勻接收到光照。

2.2 藻類傳代方式的確定

嘗試了兩種傳代方式，一種是對藻類培養液進行離心，分離出藻類，再對藻類進行復溶，隨后稀釋轉接進入培養基進行傳代。使用該方法傳代后，在顯微鏡下觀察藻類形態，發現藻類損傷嚴重，需要1周甚至更長的時間才能恢復到正常狀態。

另一種是選擇用移液槍取適量原藻類培養液，轉移進入新配培養基，進行稀釋的傳代方式。該方式下在藻類傳代后隔日鏡下觀察發現其形態正常，在生長周期內狀態較穩定。

因此，最終選擇在1 ∶100(原培養液 ∶培養基)的條件下，用移液槍進行稀釋傳代，不再進行離心。傳代周期為25～32 d。

2.3 致嗅物質檢測方法的性能考察

在確定了藻類培養方式后，使用固相微萃取-氣相色譜/質譜聯用儀對藻類培養液中土臭素、2-甲基異莰醇進行檢測。

2.3.1方法的標準曲線

使用內標法進行定量，繪制標準曲線，曲線范圍在0～100 ng/L。以目標物質質量濃度為橫坐標、定量離子峰面積為縱坐標，得到土臭素擬合曲線方程為：y=1.220 988x+0.008 057，R2=0.999 3；2-甲基異莰醇擬合曲線方程為：y=0.490 214x-0.003 701，R2=0.999 9。該方法濃度點設置均勻，線性良好。

2.3.2方法的檢出限

根據檢出限計算公式MDL=3.143S(n=7)，計算得到土臭素與2-甲基異莰醇的檢出限見表4。

表4 致嗅物質的檢出限

2.3.3方法的精密度與準確度

向水體中分別加入10與20 ng/L標準物質，進行回收率與精密度實驗，土臭素與2-甲基異莰醇的加標回收率在95%～107%之間，相對標準偏差小于5%。該檢測方法的回收率較高，精密度較好。

2.4 藻類計數方式的確定

使用陽性純藻種(偽魚腥藻)進行測定(n=12)，計數平均值為538×104cells/L，相對標準偏差為2.3%。該方法計數準確，精密度較好。

2.5 藻類產生致嗅物質情況

對培養的偽魚腥藻、水華束絲藻和拉式擬浮絲藻，在傳代初期、中期、末期分別進行嗅味物質檢測，其檢出結果見表5。

結果顯示，在3種藻類傳代后的初期、中期、末期，只有偽魚腥藻可以檢出2-甲基異莰醇，其余藻類均未檢出致嗅物質，土臭素在3種藻類培養液中均未檢出。偽魚腥藻的藻類計數結果與2-甲基異莰醇的檢出數據為正相關。

表5 3種培養藻類產生致嗅物質的情況

3 結論與展望

通過條件摸索，初步建立了偽魚腥藻、水華束絲藻、拉式擬浮絲藻的培養與傳代方式。結合培養情況，確定了藻類計數與土臭素、2-甲基異莰醇的檢測方法。初步搭建了藻類計數與致嗅物質相關性研究平臺。未來，應進一步采用所確定的方法開展藻類培養的相關研究。同時聯系實際供水生產需要，找到水體中各類致嗅物質與相關藻類的關系，深入研究藻類對環境、水質的影響，從而更好地摸索出藻類致嗅物質的控制方法，提升供水水質。