不同脫脂試劑對家兔骨骼標本脫脂效果的影響

牟思洋，王向群，星宗伯，李偉琪，聶凡皓，于雷

（青島農業大學海都學院，山東 煙臺 265200）

動物骨骼標本是觀察動物體基本結構和形態架構最直接、最簡單的施教工具之一[1-3]，且在使用過程中具有不受時間和地點局限的優點。動物骨骼標本的制作一般包括剝皮取肉、脫脂、漂白、拼接、保養等環節。由于骨骼的骨骼腔和骨松質中含有一定的脂肪成分，且脂肪往往存在于骨骼內部或腔隙過小的部位。若處理不當，脂肪便會慢慢溢出，使骨骼發黃、發黑，影響美觀，進而縮短骨骼標本的使用壽命。因此，脫脂是骨骼標本制作中至關重要的環節[4]。目前，骨骼標本制作使用的脫脂試劑多為氫氧化鈉（NaOH）等堿性試劑，盡管脫脂效果佳，但其具有的腐蝕性對致密程度較低的骨骼破壞性較大[5]。脂肪酶可水解甘油三酯等油性物質，可催化酯水解、酯合成、酯交換等有機反應[6-8]，目前主要應用于皮革等物品的脫脂[9-10]，但關于脂肪酶在骨骼標本制作中脫脂的應用與研究尚未見報道。本研究選取了脂肪酶、氫氧化鈉、丙酮、氫氧化鉀等4種試劑對家兔骨骼進行脫脂處理，以了解脂肪酶在骨骼標本中的脫脂效果，為骨骼標本的制作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇成年健康家兔4只，購自山東省萊陽市某活雞店，平均體重約2.5 kg，取下四肢，分別記為1、2、3、4號。

1.2 試驗儀器

解剖盤、手術刀、手術剪、電磁爐、鐵鍋、電子天平等均由青島農業大學海都學院基礎獸醫學實驗室提供。

1.3 試驗試劑

胰蛋白酶（國藥集團）、脂肪酶（北京鴻潤寶順生物科技有限公司）、丙酮溶液（青島農業大學海都學院基礎獸醫學實驗室）、3%過氧化氫溶液成品（山東利爾康醫療科技股份有限公司）、10%氫氧化鉀溶液（福州飛凈生物科技有限公司）；其他試劑均為國產分析純試劑。

1.4 試驗方法

1.4.1 家兔處死

家兔提前禁食1 d，為最大程度降低家兔骨骼損傷采用空氣栓塞法處死。

1.4.2 剝皮去肉

在避免損傷骨骼的基礎上，分離死亡的家兔四肢與軀干。四肢毛皮環切剝下，剔除大塊肌肉、組織等附著物。家兔骨骼按照不同兔子的前肢、后肢分組浸泡于胰蛋白酶溶液內，浸泡1～2 d后取出，清水洗凈、晾干。其中胰蛋白酶溶液按照胰蛋白酶∶蒸餾水=1∶500的比例配制。

1.4.3 脫脂

4只家兔的四肢依次放入飽和脂肪酶、丙酮、3%氫氧化鈉和3%氫氧化鉀溶液中進行脫脂。其中飽和脂肪酶置于37℃恒溫箱中以保持酶的活性，其余試劑在室溫下脫脂。記錄在相同時間內4種脫脂劑的脫脂效果。于脫脂后的8、16和24 h觀察并記錄骨骼色澤、潔白度、骨骼松弛度、殘留附著度及骨骼表面油脂浸出等情況。待觀察記錄完畢后將骨骼洗凈，晾干。

1.4.4 漂白

使用3%過氧化氫對脫脂后的骨骼進行漂白，浸泡24 h觀察并記錄骨骼及韌帶完整性、顏色和光澤度。漂白完成后，重復清洗2～3次，陰干，觀察記錄最終漂白效果。1.4.5保存

在常溫和保持通風的條件下，漂白后的骨骼于陰涼干燥處避光保存150 d后觀察期保存效果。

2 結果與分析

2.1 4種試劑處理家兔骨骼的去肉效果（見圖1）

由圖1可知，胰蛋白酶對于骨骼上的軟組織處理效果較好，除少部分難以消化的筋外，骨骼表面肌肉、角質化物質柔軟易去，經沖洗后均脫落，骨骼縫隙的細小肉絲也已去除干凈。晾干后，骨體表面開始有油脂浸出，呈黃白色交替，且骨股頭出現黑色骨髓沉積。

圖1 4種試劑處理家兔骨骼的去肉效果Fig.1 Meat removal effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones

2.2 4種試劑處理家兔骨骼的脫脂效果（見表1）

由表1可知，脂肪酶在24 h脫脂后可達到預期效果，脫脂充分且骨骼未遭到損傷；丙酮在24 h后未達到預期效果，骨骼無損傷但脫脂不充分；3%氫氧化鈉溶液和3%氫氧化鉀溶液在24 h后脫脂達到預期效果，脫脂充分但骨骼的硬度和質地存在一定損傷。

表1 4種試劑處理家兔骨骼的脫脂效果Tab.1 Degreasing effect of four kinds of reagents on rabbit bones

2.3 4種試劑處理家兔骨骼的漂白效果（見圖2、表2）

圖2 漂白后的家兔骨骼Fig.2 Rabbit bones after bleaching

由圖2、表2可知，從骨體完整度角度考慮，經脂肪酶、丙酮脫脂后的骨骼再經過氧化氫漂白后，骨體堅硬無損傷；氫氧化鈉及氫氧化鉀脫脂后的骨骼經漂白后均有不同程度的損傷，如裂隙、硬度下降等。從骨骼顏色角度考慮，經脂肪酶脫脂的骨骼顏色發白，光澤發亮，附著污物少。綜合整體考慮，使用脂肪酶脫脂的骨骼經漂白后的骨體完整度和骨骼顏色最優。

表2 家兔骨骼漂白后效果比較Tab.2 Comparison of effects of rabbit bones after bleaching

2.4 4種試劑處理家兔骨骼的保存效果（見表3）

由表3可知，由于前期脫脂時經過間較短，仍存在部分油脂滲出情況，但脂肪酶在油脂滲出最少的情況下仍保持著骨質完整度高、骨質好、骨骼較白的效果。丙酮雖然達到脫脂目的但完成度不及脂肪酶，且整體泛黃。氫氧化鈉和氫氧化鉀不僅油脂滲出和脂肪殘留較上述兩種試劑多，而且腐蝕痕跡嚴重。

表3 4種試劑處理家兔骨骼的保存效果Tab.3 Preservation effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones

3 討論

3.1 試驗動物的選取

制作骨骼標本前，應注意家兔的年齡和體型。家兔年齡過小、過大或體型瘦弱、發育不良，制作的骨骼易出現形態結構不明顯或骨質脆弱的現象，進而導致骨骼標本最后價值受到影響[5]。而家兔體型過于肥胖或年齡過大，附著在骨骼上的脂肪多于正常體型的家兔，將延長骨骼脫脂的時間，加大試劑使用劑量，還提高了脫脂不到位的風險。

3.2 腐蝕去肉的方法

骨骼標本制作方法中，傳統的蟲噬法、土埋法等制作周期過長且污物殘留較難清洗干凈[11]，化學試劑腐蝕法多選用氫氧化鈉溶液。氫氧化鈉溶液雖然可以很大程度地軟化水解蛋白質，但經過人工剔除的骨骼大部分骨體裸露，氫氧化鈉對骨骼具有一定的直接腐蝕作用。

本研究中使用胰蛋白酶進行腐蝕去肉，胰蛋白酶可催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵，有效去除骨骼附著肌肉及殘留物[12]。與傳統的蟲噬法以及氫氧化鈉浸泡法相比，蛋白酶不會對骨骼本身產生不可逆的影響，可最大限度地保留骨骼的完整性，避免了對骨骼的傷害且縮短了制作周期。胰蛋白酶對人的傷害性低[13]，對環境無污染，無需擔心廢液排入下水道造成污染的問題。

3.3 不同脫脂劑的本身特性及脫脂效果

不同脫脂試劑的選擇均以最大程度析出骨體內的油脂成分，且盡可能不損傷骨骼本身為標準。吳坤成等[14]的研究表明，工業環己酮、工業乙酸乙酯、工業丙酮、天那水等試劑具備較好的脫脂效果，但均存在易燃、刺激性強等問題，且工業環己酮為3類致癌物，存在致癌的風險。

本研究選用4種脫脂試劑：脂肪酶、丙酮、氫氧化鈉、氫氧化鉀，在不同的時間段觀察其對骨骼的影響，作用效果也不同。有機溶劑丙酮是一種易溶于水且溶解度高的試劑，制作時利用丙酮對脂肪萃取的作用可實現分離骨組織與脂肪的目的[15]。由于丙酮對骨骼自身無影響，經浸泡脫脂后的骨骼完整性、硬度均無較大變化，油脂析出量符合脫脂標準，但丙酮存在刺激性強、氣味重的缺點。

氫氧化鈉與氫氧化鉀屬于強堿類物質，可與甘油三酯等油脂類物質發生皂化反應，使油脂水解脫出，但易腐蝕骨骼，損傷其完整性。經浸泡脫脂后雖油脂析出量符合標準，但骨骼本身完整度與硬度明顯下降。

脂肪酶是一種羥基酯水解酶類物質，脂肪酶所具有油-水界面的親和力，能夠在油-水界面上高速率地催化水解不溶于水的脂類物質。本研究表明，脂肪酶具有與丙酮脫脂相似的優點，即浸泡脫脂后的骨骼完整性、硬度均無較大變化，同時脂肪酶還具備丙酮不具備的安全綠色的優點。近年來，也有研究表明，十二烷基苯磺酸鈉（C18H29NaO3S，簡稱LAS）對犬骨骼的脫脂效果良好[4]，是一種高效、低毒環保的優質脫脂劑。但與本研究使用的脂肪酶相比，LAS對皮膚具有一定的刺激性[16]。

3.4 脫脂試劑安全性分析

本研究中選用的丙酮屬于有毒且易燃的危險品。在漂白過程中，選擇過氧化氫作為漂白劑時，若清洗不到位，殘留的漂白劑極易與丙酮發生爆炸反應。氫氧化鈉、氫氧化鉀均屬于強堿類物質，具有強腐蝕性，易對骨骼產生不同程度的影響。因此，堿性試劑的使用的濃度和浸泡時間均要求嚴格控制。本研究中選用的脂肪酶兼具脫脂效果較好、實惠易得、安全系數高等優點。

3.5 環境等外界因素對結果的影響

本試驗時間為冬季，導致溶劑作用時間變緩，且制作溶液時較為不便。此外，溶液的作用效果也受到光照、空氣流通等因素的影響。丙酮等試劑極易揮發，影響試驗效果。脂肪酶的脫脂程度也會受到溫度的影響，在不適的溫度下無法最大程度上發揮脂肪酶的脫脂效果。因此，在使用脫脂酶的過程中應注意環境的溫度，避免由此導致脫脂的效果不佳。

4 結論

本試驗結果表明，脂肪酶脫脂的骨骼經漂白后在骨骼硬度、完整度、潔白度等方面均優于其他脫脂試劑。此外，脂肪酶還具有安全穩定、無污染等特點，是一種安全性、實用性、經濟性俱佳的骨骼脫脂劑。