新疆部分地區綿羊常見蜱傳病原分子調查鑒定

梅杰，巴依娜，鹿夢瑤，阿合提·布爾列斯，李永帥，巴音查汗·蓋力克，李永暢

（新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

蜱能夠攜帶和傳播多種病原體（細菌、病毒和原生動物），蜱傳疾病因而受到廣泛關注。目前，我國已發現7屬117種蜱蟲和30多種新型蜱傳病原體[1]，多種蜱傳疾病也已有相關報道，如巴貝斯蟲病、泰勒蟲病、綿羊無漿體病和Q熱等[2]。新疆位于我國西北地區，草場豐富氣候復雜，利于蜱蟲滋生，已有6屬14種蜱于新疆被鑒定發現[2]。新疆肉羊存欄量為4 153.8萬只，約占全國羊養殖業13.8%。近年來，盡管有少量報道闡述了新疆地區綿羊蜱傳血液原蟲病[3-4]，但關于蜱傳播病原體的信息仍然不足。本研究對新疆部分地區綿羊常見蜱傳病原體流行特性展開調查，以期補充新疆地區綿羊血液原蟲病數據庫并為蜱傳染病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2021年從新疆克拉瑪依烏爾禾區及巴州和靜縣部分地區，隨機抽樣選取并采集散養、外觀健康、無明顯發病癥狀的綿羊作為調查對象，抽取143只羊逐只無菌頸靜脈采血，保存于2 mL EDTA抗凝管。裝入放置有冰袋的采樣箱中，詳細記錄每只羊的性別、年齡等情況，帶回實驗室。置于-4℃冰箱中，提取DNA，-20℃冰箱保存待核酸檢測。

1.1.2 試劑與儀器

瓊脂糖、溴化乙錠（Sigma公司）；TianGen血液基因組DNA提取試劑盒（晶美技術有限公司）、膠回收試劑盒（OMEGA公司）；DL2000Marker、2×Es Taq MasterMix（北京康為世紀生物科技有限公司）；pEASY-T1載體（北京全式金生物技術有限公司）。

RADIAL20臺式高速離心機（ORTO ALRESA公司）、DK-600A型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）、DYY-Ⅲ-5型電泳儀（北京六一公司）、PCR儀（Bio-Rad公司）、Motic BA400型光學顯微鏡（Motic公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

按照天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取羊血DNA，于-20℃保存，并對所提取的基因組DNA進行電泳檢測。1.2.2血涂片檢查

采集的新鮮血液滴于載玻片上，推片、甲醇固定、吉姆薩染片，10×100倍油鏡下觀察血涂片中紅細胞內有無蟲體及血液中各種細胞的形態[5]。

1.2.3 常見綿羊血液原蟲病分子生物學鑒定

以提取的血液基因組DNA為模板，滅菌雙蒸水代替模板的陰性對照，進行目的片段擴增。PCR引物反應體系和反應條件參考文獻[3]，取5 μL PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統觀察有無目的條帶；切PCR陽性反應產物目的條帶，參照膠回收純化試劑盒說明書進行膠回收，送往上海生工公司測序。1.2.4常見綿羊血液原蟲病系統發育分析

通過NCBI數據庫進行GenBank BLASTn分析，確定核苷酸序列一致性，并運用MEGA 5.0利用最大似然（ML）法，基于Kimura 2參數模型構建系統發育樹。

1.3 數據統計與分析

試驗數據采用SPPS 20.0軟進行件t檢驗和單因素方差分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 常見綿羊血液原蟲病病原檢測結果

血涂片鏡檢結果顯示，兩個地區的綿羊血涂片均未發現明顯蟲體。

2.1.1 不同地區常見綿羊血液原蟲病原PCR檢查結果（見表1）

由表1可知，兩個地區的綿羊無漿體陽性率為5.32%（5/94）、100%（49/49）；而羊感染伯氏立克次氏體的陽性率分別為7.45%（7/94）、42.86%（21/49）。巴音郭楞和靜縣地區綿羊無漿體和伯氏立克次氏體感染情況比克拉瑪依烏爾禾地區嚴重，且兩地均未檢出其他血液原蟲病。

表1 不同地區常見綿羊血液原蟲病原PCR檢查結果Tab.1 PCR test results of common sheep blood protozoa in different regions

2.1.2 不同性別常見綿羊血液原蟲病原PCR檢查結果（見表2）

由表2可知，公羊的綿羊無漿體陽性數極顯著低于母羊（P＜0.01）。

表2 不同性別常見綿羊血液原蟲病原PCR檢查結果Tab.2 PCR test results of common sheep blood protozoa in different genders

2.1.3 不同年齡常見綿羊血液原蟲病原PCR檢查結果（見表3）

表3 不同年齡綿羊血液原蟲病原PCR檢查結果Tab.3 PCR test results of common sheep blood protozoa in different ages

由表3可知，各年齡段均有無漿體和伯氏立克次氏體感染，各年齡段感染情況差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 綿羊血液原蟲系統進化發育分析

2.2.1 綿羊無漿體部分PCR擴增結果及系統發育分析（見圖1、圖2）

由圖1可知，綿羊無漿體進行凝膠電泳得到約為

圖1 綿羊無漿體PCR檢測結果Fig.1 PCR results of Anaplasma ovis in sheep

由圖2可知，3株綿羊無漿體的OL859534基因序列的分歧度和相似性差異不大。新疆株與德國株和美國株相似性達99.0%～99.9%；分歧度1.0%～0.1%。

2.2.2 綿羊伯氏立克次氏體部分PCR擴增結果及系統發育分析（見圖3、圖4）

由圖3可知，伯氏立克次氏體進行凝膠電泳得到約為501 bp的目的條帶。

圖3 綿羊伯氏立克次氏體PCR檢測結果Fig.3 PCR results of Coxielle burnetii in sheep

由圖4可知，本試驗檢出的伯氏立克次氏體序列與GenBank中存在綿羊無漿體的法國、阿聯酋、尼日利亞、俄羅斯4個國家共17條序列并一支，序列包括：法國株（EU88863）、阿聯酋（MW057693）、北京株AY251297、AY251298）、西伯利亞株（MK335931）等。其中本文測定的伯氏立克次氏體序列與法國株和突尼斯株相似性最大，達到97.0%～99.9%。347 bp的目的條帶。之后產物送往上海生工有限公司測序，運用MEGA 5.0進行系統發育分析，見圖2。

圖2 綿羊無漿體系統發育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Anaplasma ovis

圖4 綿羊伯氏立克次氏體系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Coxielle burnetii

3 討論

伯氏立克次氏體作為人畜共患病的病原可引起人的Q熱。雖然許多病例無癥狀，但Q熱的癥狀因人而異，以流感樣疾病和肌痛等為主，國外已有報道其感染情況。Sun等[6]報道，伯氏立克次氏體作為我國目前已篩選的新興病媒傳播病原體中報道最多的病原體之一，進行區域內的研究利于降低其對全球健康構成的影響[6]。感染伯氏立克次氏體的非妊娠動物無癥狀或表現出輕微的流感樣癥狀，小型反芻動物養殖場內主要因流產、死胎、乳腺炎等生殖疾病造成經濟損失。而且伯氏立克次氏體可持續潛伏多年，甚至會終生攜帶病原體而無相關并發癥[7-8]。

本試驗中，調查范圍內的綿羊亦無明顯臨床癥狀，且伯氏立克次氏體陽性率為37.76%，高于前期在新疆部分區域內牛感染伯氏立克次氏體（20.5%）和湖北省的山羊陽性率（4.7%）[9-10]。此外，對不同年齡綿羊感染情況調查結果發現，成年綿羊無漿體陽性率高于幼年，Q熱的陽性率在幼年時較高，可能是由于幼年綿羊免疫系統發育不完全，機體抵抗力較差，容易受到感染侵害。

無漿體病的病原是寄生于動物血細胞內的血液寄生蟲，主要經蜱和吸血昆蟲傳播，廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區，溫帶地區也有少量分布[4]。1983年首次在新疆發現綿羊無漿體感染，隨后內蒙古等地相繼出現相關的報道[11]。無漿體疾病的流行多發生在蜱和各種吸血昆蟲活動的季節[12]，雨量稀少的地區傳播媒介的數量有所減少，當地綿羊無漿體病例也相對較少。各種蜱蟲均可通過吸血的方式機械傳播病原，而經卵傳遞和發育階段性傳遞試驗均未使綿羊遭到感染。本調查推測，調查地區的蜱蟲可能是綿羊無漿體普遍感染的重要原因之一，某些病例也可能經胎盤垂直感染[13]，造成一定程度的幼年綿羊感染。無漿體原蟲通過硬蜱傳播的陽性率較高[14-15]，進一步表明了蜱蟲傳播的廣泛性。本調查公羊的陽性數高于母綿羊無漿體陽性數可能是由于本次公羊的樣本數量太少，導致結果存在誤差而不足以說明具體情況。

根據前期相關報道，已知綿羊體內攜帶綿羊泰勒蟲、綿羊巴貝斯蟲等病原，但本調查并未發現上述病原體，可能與不同地理位置媒介蜱的分布及其生態環境不同有關。我國羊泰勒蟲病的傳播媒介為青海血蜱和長角血蜱，已確認青海省、寧夏回族自治區及甘肅省境內羊泰勒蟲病的傳播媒介為青海血蜱，鑒定河北省和遼寧省羊泰勒蟲病的媒介蜱是血蜱屬的蜱，河南省羊泰勒蟲病的媒介蜱則為長角血蜱，新疆維吾爾自治區羊泰勒蟲病的傳播媒介主要為小亞璃眼蜱。本調查發現，所采集樣點的無漿體陽性率較高，可能是當地的地理環境為蜱等宿主的生存提供了良好條件。與以往其他地區相比，綿羊感染無漿體平均陽性率小幅度上升，各地區陽性率差異性較大，可能與當地的蜱蟲種類不同、環境（濕度和溫度）以及飼養管理方面有關[4]。

4 結論

本研究發現，兩區域內均存在綿羊無漿體和伯氏立克次氏體感染情況，表明本地動物中存在一定潛在感染風險。伯氏立克次氏體可引發人與動物共患病，今后需加大調查與防控力度，提高人與動物健康水平。