miR-204在頸動脈粥樣硬化患者血漿中表達及其在ox-LDL誘導的巨噬細胞膽固醇積累和凋亡中的調控作用

張麗麗 梁娜娜

(1揚州大學醫學院臨床醫學系，江蘇 揚州 225200；2江蘇省人民醫院浦口分院神經內科)

頸動脈粥樣硬化(CAS)是由于巨噬細胞源性泡沫細胞在頸動脈內壁積累形成硬化斑塊及病變，導致頸動脈壁增厚，動脈腔狹窄。頸動脈斑塊的不斷生長或脫落會造成腦供血不足，引發缺血性腦卒中，嚴重危害中老年人健康〔1〕。CAS受到遺傳、飲食和環境等多種因素影響〔2,3〕。脂代謝異常引發的巨噬細胞泡沫化是頸動脈斑塊形成的主要因素〔4〕。既往研究發現血液中的氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)可以誘導血管內皮細胞功能失常，引發巨噬細胞內膽固醇積累，并引發巨噬細胞自噬、凋亡，促進巨噬細胞泡沫化〔5,6〕，然而ox-LDL誘導巨噬細胞泡沫化的遺傳調控機制還不是很清楚。MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約22 nt的小非編碼RNA，其可以通過與靶基因mRNA特定序列互補配對，調控靶基因的穩定性和翻譯活性，影響其下游基因的表達〔7〕。當前的研究發現，許多miRNAs深度參與了ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化的過程〔8～10〕。本研究通過分析CAS患者與健康志愿者血漿樣品中miR-204的表達，進一步利用體外ox-LDL誘導巨噬細胞泡沫化的實驗模型，揭示了miR-204在調控巨噬細胞膽固醇積累和凋亡過程中的重要作用。

1 材料和方法

1.1一般資料 (1)CAS組：選擇2016年9月至2017年6月在揚州大學醫學院附屬江都人民醫院神經內科經頸動脈超聲檢查診斷明確的CAS患者35例，男21例，女14例；年齡51～77歲，平均年齡為(67.3±9.1)歲。納入患者均排除出血或缺血性腦卒中、自身免疫性疾病、惡性腫瘤及肝、腎、心肺功能障礙。(2)對照組：選擇同期醫院體檢正常者30例，其中男17例，女13例，年齡47～78歲，平均年齡(66.2±9.7)歲。

1.2試劑和耗材 血漿和血清miRNA提取試劑盒(美國QIAGEN公司)，佛波酯(PMA)、膽固醇含量測定試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)，莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)反轉錄試劑混盒(北京全式金公司)，SYBR綠色熒光PCR預混液(美國Roche公司)，RPMI1640培養基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、異硫氰酸熒光素(FITC)-膜聯蛋白(Annexin)V(美國ThermoFisher公司),人單核細胞白血病細胞(THP-1，武漢普諾賽生命科技有限公司)，人源ox-LDL(上海翊圣生物科技公司)，CCK-8細胞活力檢測試劑(日本同仁化學)，飽和油紅O染色液(北京索萊寶生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1樣本的收集 使用乙二胺四乙酸(EDTA)采血管采集CAS組和對照組空腹靜脈血5 ml，血液樣品自然沉降2 h后，放置于4℃預冷的離心機中，2 000 r/min離心10 min，收集上層血漿，隨后采用QIAGEN公司的血漿和血清miRNA提取試劑盒抽提血漿樣品中的總RNA，抽提方法按照產品說明書進行。

1.3.2RNA提取純化及熒光定量PCR檢測 取1 μg總RNA，加入多聚胸腺嘧啶、T重復寡核苷酸引物，放置于70℃孵育5 min，隨后立即放置于冰上退火。在反應體系中加入M-MLV反轉錄酶、5×反應緩沖液、RNA酶抑制劑，于42℃孵育1 h，得到cDNA。以cDNA為模板，使用SYBR綠色熒光PCR預混液進行實時熒光定量PCR檢測miR-204的表達水平。miR-204特異性引物序列正義鏈：5′-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3′，反義鏈見試劑盒；選擇U6基因為內參，其特異性引物序列為：U6-正義鏈：5′-GCTTCGAGGCAGGTTACATG-3′；U6-反義鏈：5′-GCAACACACAACATCTCCCA-3′。

1.3.3細胞培養及轉染 THP-1生長于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，放置在37℃、5% CO2培養箱中培養。實驗前，在培養基中加入終濃度為100 ng/ml的PMA處理48 h，誘導細胞分化為巨噬細胞，隨后轉染對照miRNA(NC-miRNA)或miR-204模擬物(mimic)，并用100 μg/ml ox-LDL孵育48 h。THP-1源性巨噬細胞分為4組：NC組，轉染NC-miRNA；miR-204組，轉染miR-204 mimic；ox-LDL+NC組，轉染NC-miRNA，并加入ox-LDL誘導；ox-LDL+miR-204組，轉染miR-204 mimics，并加入ox-LDL誘導。

1.3.4細胞內膽固醇含量檢測 收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液清洗后，細胞冰上裂解后，3 000 r/min離心去除細胞碎片，并將上清分成3份，分別按照產品說明書測定細胞內總膽固醇、游離膽固醇和蛋白濃度，并計算膽固醇/蛋白相對含量(μg/mg蛋白)，細胞膽固醇脂含量計算公式為：膽固醇脂=總膽固醇-游離膽固醇。

1.3.5油紅O染色 取0.1 g油紅O粉末溶于10 ml異丙醇中，充分溶解后放置于4℃冰箱保存。染色前，將油紅O溶液與蒸餾水按照2∶3比例充分混勻，得到油紅O染色液。收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液洗1次，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min,隨后加入500 μl油紅O染色液，染色30 min，用磷酸鹽緩沖液漂洗3次。

1.3.6CCK-檢測細胞活性 各組THP-1源性巨噬細胞等量接種于96孔板中(每孔2×105個)，待細胞充分貼壁后進行轉染和ox-LDL處理。48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續放置于37℃培養4 h。使用酶標儀讀取450 nm波長的吸光值A，并計算相對細胞活性。

1.3.7流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，經磷酸鹽緩沖液漂洗1遍，調整細胞密度至2×106個/ml，取200 μl，1 000 r/min離心，收集沉淀細胞，加入200 μl Annexin V結合緩沖液重懸，再加入10 μl FITC-Annexin V染色液，室溫避光孵育15 min，再加入300 μl結合緩沖液，混勻后用流式細胞儀檢測，統計FITC陽性細胞比例。

1.4統計學分析 采用統計軟件GraphPad7.0進行t檢驗。

2 結 果

2.1外周血血漿中miR-204的表達 CAS組血漿中miR-204表達水平顯著低于對照組(0.72±0.12 vs 1.00±0.09;P<0.05)。

2.2THP-1細胞膽固醇脂積累檢測 相比于NC組或miR-204組，ox-LDL+NC組和ox-LDL+miR-204組細胞總膽固醇和膽固醇脂含量均顯著上升(P<0.05)，表明ox-LDL處理引起了巨噬細胞內的膽固醇積累。與ox-LDL+NC組相比，ox-LDL+miR-204組細胞總膽固醇含量沒有明顯變化(P>0.05)，膽固醇脂含量顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞膽固醇脂及點膽固醇比較

細胞膽固醇脂主要貯存在脂滴中。使用油紅O對各組細胞染色標記脂滴，從圖1可以看出，與NC組和miR-204組相比，ox-LD+NC組和ox-LDL+miR-204組細胞內脂滴的大小明顯增大，數量明顯變多。然而ox-LDL+miR-204組中脂滴明顯小于ox-LDL+NC組。

2.3細胞凋亡水平檢測 凋亡細胞FITC-Annexin V染色呈陽性(圖2)。與NC組和miR-204組相比，ox-LDL+NC組和ox-LDL-miR-204組細胞凋亡率顯著上升(均P<0.05)，而與ox-LDL+NC組相比，ox-LDL+miR-204組細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。見表2。

圖2 FITC-Annexin V染色檢測細胞凋亡水平

2.4細胞活力檢測 與NC組相比，miR-204組細胞活力沒有明顯變化(P>0.05)。與NC組和miR-204組比較，ox-LDL+NC組和ox-LDL+miR-204組細胞活力顯著下降(均P<0.05)。與ox-LDL+NC組相比，ox-LDL+miR-204組細胞活力顯著上升(P<0.05)。見表2。

白色箭頭指示細胞內的脂滴圖1 各組油紅O染色標記細胞內脂滴(×400)

表2 各組細胞活力及凋亡率比較

3 討 論

CAS會導致頸動脈腔狹窄，引起腦供血不足，甚至誘發缺血性腦卒中，帶來嚴重的健康風險〔1〕。在CAS的疾病進展過程中，由于脂質代謝出現異常，外周血中的單核-巨噬細胞被脂質浸潤，并大量攝取血清中的LDL及膽固醇，游離膽固醇進一步在細胞內固化成為膽固醇脂，貯存在脂滴中，引起巨噬細胞泡沫化，成為泡沫細胞〔11〕。泡沫細胞中脂質的積累帶來的脂毒性會引發巨噬細胞程序性死亡，并通過分泌大量細胞因子增強局部炎癥，也導致血管內皮細胞功能異常，最終形成粥樣硬化斑塊〔12〕。

血漿中存在大量的外泌體介導細胞間通訊，外泌體中含有的大量miRNA和蛋白參與了許多疾病的進展過程，并可以作為疾病的診斷提供依據〔13〕。研究表明，miRNA作為重要的遺傳調控因子，通過調控巨噬細胞、血管內皮細胞的功能，影響了CAS疾病進展〔1〕。Koga等〔14〕發現miR-204在家族性地中海熱病人血清中的表達水平明顯下降，而細胞水平的實驗也表明miR-204可以抑制脂多糖引起的巨噬細胞活化及炎癥因子的釋放。本研究結果提示miR-204可能參與了CAS疾病的發生過程，過表達miR-204可以抑制ox-LDL引發的巨噬細胞膽固醇脂的積累，而不影響總膽固醇的攝取，在巨噬細胞中過表達miR-204可以抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞活力下降和凋亡，推測其原因可能是由于膽固醇脂積累減少緩解了細胞脂毒性。Yan等〔15〕利用小鼠巨噬細胞RAW264.7研究發現，miR-204可以靶向細胞周期依賴性激酶抑制因子(CDKN)2A,調控巨噬細胞的凋亡，然而miR-204調控巨噬細胞膽固醇脂積累的作用機制還需要進一步研究探討。

綜上所述，miR-204在CAS患者血漿中含量下降，其在調控巨噬細胞泡沫化過程中發揮了重要的調節作用。而含有miR-204的外泌體是否可以緩解CAS的疾病進展還需要動物實驗探究。