miR-133在急性冠脈綜合征中表達水平及臨床意義

張文靜 孫璐 孫彬

(濰坊醫學院附屬益都中心醫院，山東 濰坊 262500)

急性冠脈綜合征(ACS)是一組由心肌嚴重缺血所導致的進展性臨床綜合征，多為冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲，繼發完全或不完全閉塞性血栓形成引起〔1〕。研究指出，內皮細胞功能的正常發揮及炎癥反應的調節是ACS發生和進展過程中重要環節〔2〕。目前對于ACS的診斷主要依賴高分辨率影像學成像技術和循環血生化標志物的檢測，但是存在費用昂貴，診斷準確率有限的問題〔3，4〕。因此，亟需更加準確的診斷和治療方法來對ACS患者進行早期診斷并提供及時治療。微小RNA(miRNAs)是一系列內源性無蛋白編碼功能的小RNAs〔5〕。研究表明，miRNAs是ACS診斷和治療的潛在靶點〔6，7〕。miRNAs通過調控血管內皮細胞功能及炎癥反應兩個關鍵環節，發揮改善ACS預后的作用〔8，9〕。雖然目前已經揭示了部分功能miRNAs〔10〕，但是miRNAs在ACS中發揮作用的分子機制尚不清晰，極大阻礙了ACS疾病治療的發展和創新。本實驗評估miR-133在ACS患者中的診斷價值，并探究其對血管內皮細胞增殖和遷移的調控作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集80例ACS患者(ACS組)及80例健康人為對照(對照組)。患者在濰坊市益都中心醫院通過冠狀動脈造影進行確診。本研究不包括有腎病史、糖尿病史和嚴重左室收縮功能障礙的ACS患者。在行冠狀動脈造影之前收集患者血清。血清經離心分離后保存于-80℃進行進一步分析。本研究經濰坊市益都中心醫院醫學倫理委員會審查批準，所有患者都簽署書面的知情同意書。

1.2細胞培養和轉染 HUVECs在含有10%胎牛血清(FBS；PAN，Aidenbach，Germany)和含1%鏈霉素和青霉素的DMEM培養基中培養，溫度37℃，5% CO2。待細胞長至對數生長期，按照說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)分別轉染模擬物對照物(mimic NC)、miR-133模擬物(miR-133 mimic)、抑制劑對照物(inhibitor NC)、miR-133抑制劑(miR-133 inhibitor)。

1.3RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR) qRT-PCR檢測血清miR-133水平。使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA，使用反轉錄試劑盒(TaKaRa，美國)進行反轉錄。以U6位內參，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(購自美國Biosystems公司)對miR-133的表達水平進行檢測。反應條件：95℃ 15 min；94℃ 15 s；55℃ 30 s；70℃ 34 s，共40個循環。反應結束后，使用2-ΔΔCt方法對miR-133的相對表達量進行計算。

1.4CCK-8法檢測細胞增殖能力 將轉染后處于對數生長期的細胞以每孔1 000個細胞的標準接種于96孔板中，連續培養3 d，每隔24 h進行檢測，檢測前向培養孔中添加10 μl CCK-8試劑，在培養箱中孵育2 h后，放置酶標儀上震蕩10 min，檢測490 nm處的吸光值，連續檢測3 d，用來評估miR-133對細胞活力的影響。

1.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 穩定轉染的細胞(5×104個/孔)懸液添加至Transwell的上室中，下室添加500 μl含10% FBS的培養基。放置培養箱中過夜培養，取出小室，用棉簽將上室的細胞及基質膠擦拭掉，小室放在4%的多聚甲醛中固定10 min，加0.1%的結晶紫染色20 min，雙蒸水清洗后，在顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照并計數，檢測細胞的遷移能力。

1.6統計學分析 采用SPSS19.0和GraphPad Prism5.0軟件進行t檢驗、方差分析χ2檢驗。受試者工作特征(ROC)曲線評估血清miR-133在NPC患者中的診斷價值，計算曲線下面積 (AUC)。通過Pearson相關系數分析血清miR-133表達水平與臨床各指標的相關性。

2 結 果

2.1研究群體臨床病理特征 兩組年齡、性別、吸煙史、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白均無顯著差異(P>0.05)。ACS組心臟型脂肪酸結合蛋白、血管性血友病因子、血清白細胞介素(IL)-6、血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、血清IL-1β水平均顯著高于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組臨床病理特征比較

2.2兩組血清miR-133的表達水平 miR-133在ACS組血清中的表達水平高于對照組(1.463±0.233 vs 1.006±0.283)，差異有統計學意義(P<0.001)。

2.3miR-133在ACS中的診斷準確性 miR-133診斷ACS的AUC為0.892，靈敏度82.5%，特異度85.0%，臨界值為1.275。見圖1。

圖1 miR-133在ACS中診斷準確性ROC曲線

2.4ACS患者中miR-133與內皮損傷和炎癥的關系 ACS患者的血清miR-133的表達水平與心臟型脂肪酸結合蛋白(r=0.576)、血管性血友病因子(r=0.707)、血清IL-6(r=0.725)、血清TNF-α(r=0.654)、血清IL-1β的水平呈顯著正相關(r=0.420，均P<0.001)。

2.5miR-133對VSMC細胞增殖和遷移的影響 VSMC細胞轉染miR-133 mimic后，miR-133的表達水平顯著升高，相反，轉染miR-133 inhibitor顯著抑制了miR-133的表達水平。miR-133高表達顯著促進了VSMC細胞增殖和遷移能力，相反，miR-133低表達則顯著抑制了VSMC細胞的增殖和遷移能力。見表2。

表2 miR-133對HUVEC細胞增殖和遷移能力的影響

3 討 論

miRNAs在包括心腦血管疾病在內的多種人類疾病中起到關鍵作用〔11〕。循環miR-195-3p升高被證明是心力衰竭患者的診斷性生物標志物〔12〕。miR-487b能夠通過IL-33/ST2信號通路減少心肌凋亡和炎癥反應，從而改善慢性心力衰竭〔13〕。本研究結果發現miR-133在ACS中高表達。研究表明，miR-133在各種心血管疾病中發揮了重要的生物學功能。Navickas等〔14〕發現，血清miR-133在心血管疾病中顯示出一定的診斷的潛力。過表達miR-133具有抑制內皮細胞增殖和遷移的作用〔15〕。

ACS是一種復雜的表型，受環境和遺傳因素的影響，其病理過程包括內皮細胞功能障礙、炎癥改變及血栓成分之間的相互作用〔16〕。ACS患者的冠狀動脈疾病的病理進展非常迅速，早期診斷和預后治療治療ACS是至關重要的〔17〕。本研究相關性分析結果發現，ACS患者血清miR-133的表達水平與血管內皮損傷標志物的水平顯著正相關。炎癥和內皮功能障礙在ACS患者急性治療和長期管理中也起重要作用。已有研究報道，miR-133通過調控機體的炎癥反應，參與多種疾病的進展〔18，19〕。本研究結果說明miR-133可能通過調控機體的炎癥反應，參與ACS的進程。

雖然在臨床方法中已經有了一些進展，但ACS患者的預后仍然不佳〔20〕。研究表明，在ACS的發展過程中，血管內皮細胞(VECs)功能障礙是參與ACS發病機制的重要因素〔21〕。此外，已有miRNAs被證實參與HUVECs細胞的增殖和遷移進程的調控〔22〕。例如，Luo等〔2〕在小鼠中研究發現，miR-150通過調控內皮細胞的增殖和遷移參與ACS的進程。在本研究中，我們進一步驗證了miR-133在血管內皮細胞功能障礙中的作用。通過調控miR-133在HUVECs細胞中的表達水平，我們發現，miR-133高表達顯著促進了VSMC細胞的增殖和遷移能力，相反，miR-133低表達則顯著抑制了VSMC細胞的增殖和遷移能力。綜上所述，miR-133在ACS患者中高表達，是ACS早期診斷的一個潛在生物標志物，miR-133可能通過調控血管內皮細胞的增殖和遷移參與疾病的進程。