基于化學計量學結合甘油二酯和甘油三酯分析的橄欖油等級的鑒別

趙善貞， 封卓然， 包 明， 伊雄海， 鄧曉軍， 郭德華， 丁 濤， 柳 菡

(上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心1，上海 200135) (南京海關動植物與食品檢測中心2，南京 210000)

橄欖油屬木本植物油，是由新鮮的油橄欖果實直接冷榨而成的，被認為是迄今所發現的油脂中最適合人體營養的油脂。橄欖油的主要成分是甘油三酯(Triglycerides，TAGs)和甘油二酯(Diacylglycerol，DAGs)，其中甘油三酯質量分數高達95%～98%[1]，其余成分包括游離脂肪酸、甾醇、酚類物質等，這些物質在橄欖油在加工過程中會產生一定變化。為了對橄欖油的真實屬性進行確認，歐盟[2]和國際橄欖油理事協會[3]早在90年代就建立了橄欖油和橄欖果渣油特性及分析方法法規，我國在2019年也制定了橄欖油分級的相關標準法規[4]。

除了制定與施行各種標準法規以外，有效的橄欖油摻偽檢測手段也尤為重要，橄欖油的真偽鑒別[5-6]和質量分級檢測[7-9]一直以來都是國內外學術界的研究熱點。近年來，隨著化學計量學的大力發展，采用主成分分析和聚類分析等統計學方法，研究食品化學測量值與體系的狀態之間建立聯系成為一個研究熱點[10-13]，國內針對油脂化學計量學現有報道涉及橄欖油的微量元素[14-15]、脂肪酸[16]、風味物質[17]，揮發性特征成分[18]等。國外對油脂的真實屬性進行確認，也建立了較多計量學分析方法[19]。對不同產地、品種橄欖油的鑒別[20-22]；不同種類油脂或者摻假鑒別[23-27]，方法多采用橄欖油中的TAGs、DAGs結合甾醇類，脂肪酸等的檢測，并進行化學計量學分析，未有僅采用TAGs、DAGs進行檢測，結合化學計量學分析的報道。而針對對不同等級橄欖油中的鑒別有紫外吸收光譜分析[28]，毛細管電泳法[29]，甘油二酯和脂肪酸之間的比例[30]，以及甘油二酯同分異構體之間的差異[31]等。采用紫外吸收光譜分析方法，影響檢測結果準確度的因素較多；毛細管電泳法方法直接通過不同等級橄欖油的電子影像分析圖差異來進行PCA分析，方法對圖譜要求較高；而采用氣相色譜-質譜法測定橄欖油中的甘油二酯和脂肪酸含量，前處理通常需要衍生，較為繁瑣。本方采用高效液相色譜-大氣壓化學電離源-質譜/質譜法對初榨橄欖油和精煉橄欖油中的DAGs和TAGs進行測定，樣品經稀釋后直接上機分析，根據測得的DAGs以及TAGs的母離子、子離子進行定性分析，推測可能的DAGs以及TAGs類型，再對各類型的DAGs和TAGs進行定量分析，結合化學計量學方法，對初榨橄欖油和精練橄欖油進行等級鑒別，并找出差異性物質。現有報道中，通過TAGs和DAGs含量差異結合化學計量學方法對橄欖油進行等級鑒別的方法較為少見，本方法前處理方法簡單，數據處理簡便，可為橄欖油等級鑒別提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈，丙酮 (色譜純)，0.45 μm 濾膜，有機系。已確認屬性的16種初榨橄欖油和26種精煉橄欖油樣品，均收集于國內外各橄欖油企業，5種未知屬性的橄欖油作為測試樣品對建立的方法進行驗證。本方法中初榨橄欖油為1～16號樣品，精煉橄欖油為17～42號樣品，測試樣品為S1～S5號樣品。

1.2 儀器與設備

API 4000液相色譜-質譜/質譜儀，配有APCI源。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取(0.5±0.001)g 試樣于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，制備成5%的樣品溶液，經0.45 μm 濾膜過濾，液相色譜-質譜/質譜儀進行定性和定量分析。

1.3.2 液相色譜條件

借鑒何榕等[32]的方法并稍作修改。色譜柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，粒徑5 μm) 3根串聯；流動相：丙酮/乙腈(50∶50)；等度洗脫；洗脫時間：120 min；流速： 0.2 mL/min；進樣量：10 μL。

1.3.3 質譜條件

正離子模式；質荷比(m/z)范圍：300～1 050；APCI源溫度：250 ℃。

1.4 數據處理與化學計量學分析

采用SPSS 24.0 軟件對測得的DAGs以及TAGs數據進行整理，并計算不同等級橄欖油中DAGs、TAGs的組內方差和組間方差。將整理后的數據導入到SIMCA 14.0軟件中進行PCA、PLS-DA分析，并進行置換檢驗來驗證模型的可靠性。采用Metaboanalyst 6.0進行HCA分析。

2 結果與分析

2.1 DAGs以及TAGs的定性和定量分析

含有長鏈脂肪酸的DAGs、TAGs，隨著烴基碳鏈的增多極性越來越弱，而APCI源適用于弱極性化合物的檢測，因此這里采用APCI源對DAGs和TAGs進行分析。DAGs和TAGs在APCI源中主要形成3種類型的碎片離子： 酰基離子[RCO]+、單酰基甘油離子[M+H-RCOOH-RCO]+，以及二酰基甘油離子[M+H-RCOOH]+等。根據這些碎片離子峰的特征，可以推測甘油三酯的結構。

在質荷比(m/z)300～1 050內對試樣進行全掃描后，參考已有文獻[33]中DAGs以及TAGs的母離子，對掃描范圍內的母離子的質荷比進行提取。根據提取到的母離子、子離子，和已有報道的DAGs以及TAGs的母離子以及子離子進行比對，推測出可能的DAGs以及TAGs的類型。本方法檢測到的橄欖油中的DAGs包括LL、OL、OO、OS等DG，TAGs包括LLL、OLLn、OLL、OOLn、POLn、PLnP、OOL、POL、OOO、POO、POP、OMoO等，本方法檢測到的橄欖油中的甘油二酯以及甘油三酯見表1。

表1 本方法檢測到的橄欖油中的甘油二酯以及甘油三酯

根據初榨橄欖油和精煉橄欖油的定性分析結果，提取各類型的DAGs以及TAGs，對DAGs以及TAGs進行定量分析。以歸一化法計算各DAGs以及TAGs相對質量分數，2種等級橄欖油中DAGs以及TAGs的相對質量分數見表2。

表2 兩種等級橄欖油中DAGs以及TAGs的相對質量分數

2.2 不同等級橄欖油的化學計量學分析

2.2.1 DGs以及TAGs的PCA分析以及PLS-DA分析

采用SPSS 24.0軟件進行主成分分析(PCA)以及偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。方法首先以本文中所檢測到的所有DAGs以及TAGs的響應值為變量進行分析。兩種等級橄欖油等級鑒別的PCA圖及PLS-DA圖如圖1所示，可以看出初榨橄欖油樣品位于圖1右下側，精煉橄欖油樣品位于圖1的左上側，但是兩者之間分界不明顯，部分橄欖油在等級差異分析中存在難以鑒別的情況。

圖1 橄欖油等級鑒別的PCA圖及PLS-DA圖

2.2.2 數據顯著性差異分析

主成分分析的實際應用中，采取的是變量變換手段，最終目的就是為了根據實際的情況，選取幾個幾乎可以涵蓋所有總體信息的主成分，以達到降維的目的，并在此基礎上進行進一步的分析[34]。這里對兩種等級橄欖油中各DAGs和TAGs采用假設檢驗(hypothesis testing)[35]，進行顯著性差異分析。計算不同等級橄欖油中DAGs和TAGs中各變量的F值和P值。F值是各組分組間方差和組內方差的比率，F值可以用來計算各個變量對給定組分的貢獻度。F值越大，表示變量之間的差異性越大。另一個參數P值為F值的倒數，也用于表示分組錯誤的可能性。P<0.05時，該變量之間有統計學差異，P<0.01時,變量之間有極顯著差異。對上述初榨橄欖油和精煉橄欖油DAGs、TAGs各組分的峰面積的組間方差和組內方差進行計算，求出各變量的F值以及P值，對F值由大到小，即P值由小到大進行排序，甘油二酯、甘油三酯的F值和P值，由表3可以看出，DAGs中的LL、OO、OL以及TAGs中的OLLn、LLL、OOL以及OLL的P<0.05。這表明這些DAGs和TAGs存在顯著差異，和不同等級橄欖油的等級鑒別關聯性較強。

表3 甘油二酯、甘油三酯的F值和P值

2.2.3 有顯著性差異的DGs和TAGs的PCA分析以及PLS-DA分析

采用所有檢測到的的DAGs以及TAGs進行PCA和PLS-DA分析效果并不理想，因此這里取上述經顯著性差異分析后，P<0.05的橄欖油DAGs以及TAGs組分，即DAGs中的LL、OO、OL以及TAGs中的LLL、OLLn、OOL、OLL進行PCA以及PLS-DA分析。兩種等級橄欖油等級鑒別的PCA圖及PLS-DA圖如圖2所示，給出采用有顯著性差異的DGs和TAGs分析的PCA圖(圖2a)以及PLS-DA圖(圖2b)。經過顯著性差異分析后，2種不同等級橄欖油之間分離度增加， 樣品組內可得到較好的聚類分離效果，不同等級橄欖油在2個模型中的分布情況十分相似。PLS-DA作為有監督的模式判別模型，具有一定的數據過擬合風險，需要對建立的模型進行置換檢驗。作為一個可靠的有監督模型，Q2回歸線在y軸上的截距要小于0。初榨橄欖油的確證模型中，R2回歸線在y軸上的截距為-0.003 27；Q2回歸線在y軸上的截距為-0.115；精煉橄欖油的確證模型中，R2回歸線在y軸上的截距為0.003 6；Q2回歸線在y軸上的截距為-0.105，2個確證模型的Q2均小于0；這表明本方法建立的PLS-DA模型是可靠的。

圖2 橄欖油等級鑒別的PCA圖及PLS-DA圖

圖3 基于DAGs和TAGs的2種等級橄欖油鑒別的聚類分析熱圖

2.2.4 聚類分析

聚類分析(HCA)是聚類算法的一種，通過計算不同類別數據點間的相似度來創建1棵有層次的嵌套聚類樹。本方法對具有顯著性差異的DAGs和TAGs，采用HCA對進行聚類和評估變量。基于DAGs和TAGs的兩種等級橄欖油鑒別的聚類分析熱圖如圖3所示，由圖3可以看出，通過HCA分析，樣品被分為2類，且均可正確分類。由此可見，本方法采用PCA和PLS-DA建立的橄欖油鑒別方法是可靠的。

2.2.5 特征化合物的確定

在PLS-DA分析中，自變量投影重要性指標(VIP)被用于判斷單個自變量在解釋因變量時的重要性，是PLS模型的精度分析以及影響機制。對有顯著差異的TAGs和DAGs建立的PLS-DA模型，其VIP值進行考察，可以看出LL、OLLn、LLL、OO的VIP值大于1，是橄欖油等級鑒別模型的重要變量。TAGs和DAGs中的LL、OLLn、LLL、OO在2種橄欖油中的相對含量差異較大，在2種等級的橄欖油鑒別中起著重要作用。

2.3 實際樣品測定

對市售的5個精煉橄欖油樣品進行檢測后，采用建立的PCA和PLS-DA模型對樣品進行分類，橄欖油樣品都和精煉橄欖油的位置更接近，因此將該5個樣品歸類為精煉橄欖油，和樣品標簽標識一致。

3 結論

本方法采用HPLC-APCI-MS/MS法對不同等級橄欖油中的DAGs以及TAGs進行定量測定。建立了不同等級橄欖油的PCA以及PLS-DA鑒別模型。結果表明DAGs中的LL、OO，TAGs中的LLL、OLLn是橄欖油等級鑒別模型的重要變量，這4種DAGs以及TAGs在精煉橄欖油中的含量高于其在初榨橄欖油中的含量。采用HAC可以對橄欖油進行準確分類，可為不同等級橄欖油等級鑒定提供新思路。