益生菌植物提取物復合生物制劑提高免疫力的應用效果試驗

王 誠，王 杰，董桂紅，何榮彥，劉 雨，李 燕，王 玲，邢 燭，趙福平，鞏 倩，宗 倩，董曉桐

（1.山東健源生物科技有限公司，山東 泰安 271000；2.青島市即墨區農業農村局，山東 青島）

益生菌（Probiotics）是一種有取代或平衡生態系統中一種或多種菌系作用的微生物添加物，即通過補充動物消化道內的有益微生物，改善消化道菌群平衡而對動物產生有益作用，迅速提高機體的抗病能力、代謝能力和對飼料的消化吸收能力，達到防治疾病和促進生長的雙重作用。

近年來，益生菌的生產和使用量飛速增長，益生菌的使用可減少抗生素的用量，有利于生態平衡。但是，單一的外源性益生菌進入腸道后，復活后往往因為缺乏增殖所需要的營養物質而不能快速的定殖，很快被排出體外，而無法發揮其維持腸道微生態平衡的作用。

植物提取物是指采用適當的溶劑和方法，從植物（植物全部或者某一部分）為原料提取或加工而成的物質。將植物提取物和益生菌組合使用是當前研究的熱點，在動物生產中應用效果良好[1]。但是，益生菌和植物提取物的功能復雜多樣，不同益生菌、不同植物提取物的免疫激活和調節機制不同。若植物提取物和益生菌組合恰當，其以促進外源性益生菌在動物腸道中定殖和生長，并選擇性刺激腸道內源有益菌群的增殖，改善動物腸道微生態群系平衡，提高動物機體的免疫力；但若植物提取物和益生菌組合不當，其不但起不到協同增效的作用，反而有可能還會降低各自的作用。因此，開發高效配伍的益生菌-植物提取物生物制劑仍是當前的技術難點所在。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑 低聚木糖，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和產朊假絲酵母（Candida utilis），均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC），其中植物乳桿菌的菌種編號為CICC 21809，枯草芽孢桿菌的菌種編號為CICC 10071，產朊假絲酵母的菌種編號為CICC 1314，紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物均由健源生物科技有限公司提供。無特定病原體（SPF）級雄性Balb/c小鼠，體重18～22 g，SPF級雌性ICR小鼠，18～22 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。D-hanks液、小牛血清、雙抗、胰蛋白酶，乳酸脫氫酶基質液，鹽酸溶液，ConA液，MTT，甘油，蒸餾水。

1.1.2 儀器與設備 200目篩網，注射器，96孔細胞培養板，RPM1640不完全培養基，振蕩器，酶標儀，天平，超凈化工作臺，離心機，恒溫水浴箱，冰箱，相差顯微鏡，培養箱，二氧化碳注入泵，萃取器，分離器、壓縮機，二氧化碳儲罐，冷水機，吸管，玻璃瓶，培養瓶，廢液缸，吸頭，槍頭，膠塞，離心管，加樣槍。

1.2 方法

1.2.1 不同益生菌植物提取物復合生物制劑的制備 復合益生菌粉以低聚木糖作為菌粉基質，將植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和產朊假絲酵母（Candida utilis）按重量比1:1:1復配，再與菌粉基質混合均勻，制備得到復合益生菌粉。所制備的復合益生菌粉中的總活菌數≥5×108cfu/g。（1）紫花苜蓿提取物由如下方法制備而成：將紫苜蓿全草干燥，粉碎，向粉碎后的紫苜蓿中加入8～10重量倍的乙醇溶液進行回流提取，提取時間2～3 h，提取液回收乙醇后加入氧化鋁吸附雜質，過濾，收集濾液，濾液噴霧干燥，即制備得到紫苜蓿提取物。（2）淫羊藿提取物由如下方法制備而成：將淫羊藿粉碎，采用超臨界CO2進行萃取，萃取溫度為35～40 ℃，萃取壓力25～28 MPa、萃取時間2～3 h，收集萃取液；將萃取液冷凍干燥，即制備得到淫羊藿提取物。（3）益生菌植物提取物復合生物制劑的制備及原料組成（按重量份計）：復合益生菌粉2份、紫花苜蓿提取物10份、淫羊藿提取物8份。制備方法：按組方量稱取復合益生菌粉、紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物，將其混合均勻，即得。

1.2.2 復合益生菌粉、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產朊假絲酵母對NK細胞活性的影響 SPF級雄性Balb/c小鼠（購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司），體重18～22 g，適應性喂養3 d后，隨機分成5組，每組10只，分別為空白對照組、復合益生菌粉組，植物乳桿菌組，枯草芽孢桿菌組和產朊假絲酵母組；其中復合益生菌粉組灌胃復合益生菌粉組，植物乳桿菌組灌胃菌種編號為CICC 21809的植物乳桿菌菌粉，枯草芽孢桿菌組灌胃菌種編號為CICC 10071的枯草芽孢桿菌菌粉，產朊假絲酵母組灌胃菌種編號為CICC 1314的產朊假絲酵母菌粉，各組菌粉均是低聚木糖作為菌粉基質，活菌數均調整為5×108cfu/g；各組的給藥量均為50 mg/kg小鼠體質量，空白組給予相同量的蒸餾水；1次/d，連續灌胃30 d。處死小鼠，無菌取脾，置于無菌Hank′s液中，研磨，經200目篩網過濾，制成細胞懸液。8 600 r/min離心3 s，棄上清后加入Hank′s液清洗并離心，上述過程重復3次。然后調整細胞懸液中的細胞濃度到2×107個/ml，作為效應細胞。選取傳代24 h生長良好的YAC-1細胞并調整其細胞濃度到4×105個/ml，作為靶細胞。于96孔板中加入細胞懸液：靶細胞和培養液中各100 μl加入自然釋放孔，其余各孔加靶細胞和效應細胞各100 μl。上述各項均設3個平行孔，于37 ℃、5 % CO2培養箱中培養4 h，然后吸取100 μl上清液置于新板中，同時加入100 μl乳酸脫氫酶基質液，反應10 min后，每孔加入30 μl 1 mol/L的鹽酸溶液終止反應，在492 nm處利用酶標儀讀取OD值，并按以下公式計算NK細胞活性[2-3]。

1.2.3 復合益生菌粉、紫花苜蓿提取、淫羊藿提取物和益生菌植物提取物復合生物制劑對小鼠免疫機能的影響 SPF級雌性ICR小鼠（購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司），18～22 g，適應性喂養3 d后，隨機分成5組，每組10只，分別為空白對照組、復合益生菌粉組、紫花苜蓿提取組、淫羊藿提取物組和益生菌植物提取物復合生物制劑組，其中復合益生菌粉組灌胃益生菌植物提取物復合生物制劑，紫花苜蓿提取物組灌胃紫花苜蓿提取物，淫羊藿提取物組灌胃淫羊藿提取物，益生菌植物提取物復合生物制劑組灌胃益生菌植物提取物復合生物制劑，各組的給藥量均為0.1 g/kg小鼠體質量，空白組給予相同量的蒸餾水；1次/d，連續灌胃30 d。各組均正常飲食、飲水[2-3]。最后一次灌胃后，禁食12 h，測定小鼠體質量，小鼠脫頸處死，并測定各項免疫指標。（1）脾臟和胸腺的臟器指數測定。小鼠脫頸處死后，摘取脾臟及胸腺稱質量，按下式計算臟器指數。

脾臟指數（mg?g-1）=脾臟的質量（mg）/體質量（g）；胸腺指數（mg·g-1）=胸腺的質量（mg）/體質量（g）

（2）淋巴細胞增殖能力測定。無菌取脾，置于盛有無菌Hank′s液的玻璃培養皿中，制成細胞懸液，經200目篩網過濾。用無菌Hank′s液洗3次，每次離心（1 000 r/min）10 min，計算活細胞數，調整細胞濃度為2×107個/ml，每孔加入0.2 ml細胞懸液，再加入培養基至1 ml，其中一孔中加入75 μl ConA液（7.5 μg/ml），另一孔作為空白對照，繼續培養72 h。培養結束前4 h，棄掉上清液，并加入新鮮的RPM1640不完全培養基，同時加入MTT（5 mg/ml）50 μl，繼續孵育4 h。結束后去掉上清液，每孔中加入1 ml異丙醇，震蕩溶解后，置于酶標儀上測定吸光度（570 nm）[4-5]。

淋巴細胞的增殖能力=OD加ConA孔-OD不加ConA孔

1.2.4 復合益生菌粉、紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物、益生菌植物提取物復合生物制劑在育雛蛋雞中的應用 從山東省泰安市某蛋雞場的育雛蛋雞中選取部分雞只進行試驗，分成試驗1組、試驗2組、試驗3組、試驗4組和對照組5個處理，其中：試驗1組是將復合益生菌粉按1 kg復合益生菌粉兌水2 000 kg，制成給藥溶液；分別10～14日齡、免疫空白期（21～25日齡）和43～49日齡3個時期以飲水的方式給予上述給藥溶液，每次集中4～5 h飲用。試驗2組是將紫花苜蓿提取物按1 kg提取物兌水2 000 kg，制成給藥溶液；分別10～14日齡、免疫空白期（21～25日齡）和43～49日齡3個時期以飲水的方式給予上述給藥溶液，每次集中4～5 h飲用。試驗3組是將淫羊藿提取物按1 kg提取物兌水2 000 kg，制成給藥溶液；分別10～14日齡、免疫空白期（21～25日齡）和43～49日齡3個時期以飲水的方式給予上述給藥溶液，每次集中4～5 h飲用。試驗4組是將益生菌植物提取物復合生物制劑按1 kg組合物兌水2 000 kg，制成給藥溶液；分別10～14日齡、免疫空白期（21～25日齡）和43～49日齡3個時期以飲水的方式給予上述給藥溶液，每次集中4～5 h飲用。對照組在相應時間段給予等量的清水。試驗組和對照組的其他飼養條件保持一致。每天統計死淘雞只的數量，在8周末（第56天）統計雞只死淘率[6-7]。

死淘率（%）= 死淘雞只的數量/初始進雞的數量

2 結果與分析

本研究將復合益生菌粉與紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物復配使用，能同時發揮益生菌和植物提取物的雙重作用，達到1+1＞2的效果。其中，復合益生菌粉由植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產朊假絲酵母復配而成，3種菌株之間有協同增效的作用，能提高NK細胞活性；紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物與復合益生菌粉復配，不僅可以為益生菌提供營養，還可以作為免疫刺激的輔助因子發揮作用，從而顯著提高了動物的機體免疫能力。

2.1 復合益生菌粉、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產朊假絲酵母對NK細胞活性的影響

NK細胞可以非特異性的直接殺傷某些腫瘤細胞和病毒感染細胞，分泌IFN-γ和TNF-α等細胞因子，從而參與免疫調節增效機體抗感染效應。表1結果表明，與單獨使用植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產朊假絲酵母相比，將上述3種菌株復配后形成的復合益生菌菌粉能顯著增強NK細胞活性，可有效增強機體的非特異性免疫功能。

表1 對小鼠NK細胞活性的影響 （%）

2.2 復合益生菌粉、紫花苜蓿提取、淫羊藿提取物和益生菌植物提取物復合生物制劑對小鼠免疫機能的影響

脾臟指數和胸腺指數能夠直觀的反應動物的免疫功能，由表2可以看出，將復合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物進行復配，能顯著提高小鼠的免疫功能。

表2 試驗結果各處理組的脾臟和胸腺的臟器指數測定結果以及淋巴細胞增殖能力測定結果（mg·g-1）

淋巴細胞的增殖能力是體現T淋巴細胞和B淋巴細胞免疫反應水平的重要指標，結果表明，與單獨使用復合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物相比，本研究制備的益生菌植物提取物復合生物制劑能顯著提高小鼠淋巴細胞的增殖能力，其效果要優于單獨使用復合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物的效果之和。

綜合上述試驗結果可以看出，本研究制備的益生菌植物提取物復合生物制劑能提高動物機體的免疫能力。

2.3 復合益生菌粉、紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物、益生菌植物提取物復合生物制劑在育雛蛋雞中的應用

育雛蛋雞的免疫力相對偏低，是雞疾病的高發期，雞群的死淘率偏高。表3結果表明，在育雛期飼喂復合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物均能在一定程度上降低育雛蛋雞的死淘率。而將復合益生菌粉、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物組合使用后，其降低育雛蛋雞死淘率的效果更為顯著。

表3 對育雛蛋雞的作用效果

3 討論

本研究將復合益生菌粉與紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物復配使用，能同時發揮益生菌和植物提取物的雙重作用，達到1+1＞2的效果。其中，復合益生菌粉由植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌和產朊假絲酵母復配而成，三種菌株之間有協同增效的作用，能提高NK細胞活性，并能生成多種有機酸和酶類物質，抑制腸道內有害微生物的增殖，又可促進有益菌的增殖，形成一個良性循環；紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物與復合益生菌粉復配，不僅可以為益生菌提供營養，還可以作為免疫刺激的輔助因子發揮作用，從而顯著提高了動物的機體免疫能力。

如前所述，免疫力是指機體抵抗外來侵襲，維護體內環境穩定性的能力。免疫機制的異常成為引起各種疾病的原因。因此，開發能夠提高機體免疫力的產品將具有十分重要的意義。

益生菌被廣泛應用于提高免疫產品，然而其提高免疫力效果仍有待提高，究其原因是沒有考慮菌種間的協同與抑制，菌種間的這種關系影響因素包括：菌種的類別、種別以及菌種的配比等。通過菌株復配的方式尋找在提高免疫力方面協同增效作用佳、生物學功能獲得拓展的復合菌劑將有利于造福動物和人類健康。

基于此，本研究首先通過菌株復配的方式開發免疫效果協同增強的復合益生菌。

植物乳桿菌是一種重要的腸道有益微生物，植物乳桿菌所起的免疫調節作用與其菌本身和代謝產物有關，甚至死的菌體也有免疫調節作用；其對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性致病菌均有抑制作用，它通過與病原菌對限制性營養素的能力競爭，來抑制病原菌的生長，調節腸道微生態的組成，形成生物學屏障，并通過其代謝所產生的乳酸、細菌素等物質對其他細菌的作用，調整菌群之間的關系，維持和保證菌群最佳優勢組合，通過拮抗致病菌的生長及其毒素的粘附，阻止其侵入和定植。枯草芽孢桿菌在動物腸道中復蘇增殖后可發揮其益生特性，包括改善動物腸道菌群、增強機體免疫力以及提供多種動物所需的酶類等，可以彌補動物體內源酶的不足，促進動物的生長發育，具有顯著的益生作用。產朊假絲酵母本身含有豐富的酶類，如單胃蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶及植酸酶等，這些酶類可以將淀粉、纖維素水解成小分子糖、氨基酸等易被消化和吸收的低分子物質；產朊假絲酵母的細胞壁富含甘露糖和β-葡聚糖等物質，這些物質具有免疫促進劑的功能，能夠激發或增強機體免疫功能。

本研究發現，將菌種編號為CICC 21809的植物乳桿菌、菌種編號為CICC10071的枯草芽孢桿菌和菌種編號為CICC 1314的產朊假絲酵母按一定比例進行復配形成復合益生菌粉，其能夠提高NK細胞活性，進而顯著提高機體免疫力。

天然植物提取物中含有多糖、皂苷、生物堿、精油和有機酸等多種免疫有效活性成分。植物提取物的免疫調節作用是多方面的，其不僅與各種免疫細胞有關，還與細胞因子的產生和活性密切相關。同時天然植物飼料添加劑對免疫系統的影響往往受機體因素及用藥劑量的影響，呈雙向調節作用，這是植物提取物免疫機理的復雜之處。

紫花苜蓿和淫羊藿所含成分復雜，有效成分和無效成分并存，因此，有效成分和有效部位的富集是制約藥物開發的關鍵環節。本研究對從紫花苜蓿和淫羊藿中提取有效成分的工藝進行了優化，并制備得到了具有提高免疫活性的紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物。

將植物提取物和益生菌組合使用是當前研究的熱點，在動物生產中應用效果良好。但是，益生菌和植物提取物的功能復雜多樣，不同益生菌、不同植物提取物的免疫激活和調節機制不同。因此，開發高效配伍的益生菌和植物提取物生物制劑仍是當前的技術難點所在。

本研究在獲得具有提高免疫能力的復合益生菌粉和紫花苜蓿提取物、淫羊藿提取物之后，嘗試將其組合使用，考察復合之后對于動物機體免疫能力的影響。結果發現，紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物與復合益生菌粉復配，不僅可以為益生菌提供營養，還可以作為免疫刺激的輔助因子發揮作用，從而顯著提高了動物的機體免疫能力。即復合益生菌、紫花苜蓿提取物和淫羊藿提取物三者復配，在提高動物機體免疫力方面具有顯著的協同增效作用。