一例豬藍耳病與副豬嗜血桿菌病混合感染病例的診斷

王泰龍，孟凡亮, ，沈葉盛，趙伊然，李培勛，劉思當*，李寶全*

（1.山東農業大學，山東 泰安 271018；2.華云（山東）檢驗檢疫服務有限公司，山東 泰安）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征又稱豬藍耳病，是由豬藍耳病病毒（PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，易感豬群具有高發病率及高死亡率，對我國養豬業造成極大的危害[1-2]。雖然目前疫苗免疫能夠有效降低豬群的發病率和死亡率，但有研究顯示，控制豬藍耳病的關鍵是做好種豬群的免疫防控，堅持防大于治的原則[3-5]。

副豬嗜血桿菌病是以呼吸道癥狀為主的豬細菌性傳染病，對不同階段的生豬發育都會產生不良影響，對膘情較好的保育豬的影響最為嚴重。副豬嗜血桿菌是養豬場重要的條件致病菌之一，其主要存在于豬上呼吸道，以5～8周齡仔豬最為易感，其中最主要的發病時期是保育階段[6]。由于副豬嗜血桿菌血清型較多和細菌耐藥性的產生，導致目前該病發病率日漸上升。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2021年11月，泰安市某養殖戶豬群突然發病，其中以6周齡的保育豬癥狀最為嚴重，主要表現為高熱、精神萎靡、呼吸困難等癥狀。檢測樣品來自于該群病死豬的組織器官。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR儀，購自Bro-Rad公司；JY600C型電泳儀，購自北京君意東方電泳設備有限公司；SimplyP病毒DNA/RNA 共提取試劑盒，購自杭州博日科技股份有限公司；瓊脂糖粉，購自Sigma公司；Easy Script One-step RT-PCR Super Mix，普通Taq酶，DL 2 000 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢及樣品采集 對病死豬進行臨床剖檢，觀察組織器官的病變。取豬的肺臟、脾臟、肝臟和淋巴結等組織樣品保存以備用。

1.2.2 病料處理與RT-PCR/PCR檢測 將采集的組織樣品放置于研磨器后加入PBS充分研磨，-20 ℃ 冰箱中反復凍融3次后，9 000 r/min離心3 min，從上清液中提取核酸并將其作為模板進行PCR檢測，包括CSFV（豬瘟病毒）、PRRSV（豬藍耳病病毒）、PRV（豬偽狂犬病毒）、PCV2（豬圓環病毒2型）。對研磨液提取核酸，通過RT-PCR/PCR擴增，PCR產物經1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳跑膠，凝膠成像儀照相。CSFV、PRRSV、PRV和PCV2抗原片段大小分別為599 bp、1 027 bp、563 bp、785 bp。

1.2.3 細菌分離 無菌條件下使用接種環刺破預先采集好的病豬肝臟，在肝臟內反復旋轉幾圈后，使用三Z法將接種環涂于含1.5 % NAD和1 % 血清的TSA培養基上，將培養皿放置于37.5 ℃ 恒溫培養箱內恒溫培養24～36 h。挑取疑似菌落，用HPS特異性引物擴增。HPS抗原片段大小為821 bp。

1.2.4 藥敏試驗 挑取單菌落接種于含200 μl生理鹽水中反復重懸，吸取100 μl接種于普通LB板上，用玻璃棒涂勻，用K-B紙片法進行藥敏試驗，選取大觀霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等10種常用抗生素為試驗藥物，測定抑菌圈直徑并參考美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）的標準判斷耐藥（R）、敏感（S）或中敏（I）進行結果判斷與耐藥性分析。

1.2.5 組織病理學檢查 取肺組織樣品于10 %福爾馬林溶液固定，常規石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理學標本。

2 結果與分析

2.1 病理剖檢及組織病理學檢測

剖檢發現在胸、腹腔漿膜及器官表面有大量黃白色纖維蛋白滲出物，呈嚴重的纖維素性心包炎、胸膜炎及腹膜炎，淋巴結腫大，肺暗紅色實變。因大量巨噬細胞及淋巴細胞浸潤增生，使肺小葉間質增寬、肺泡壁增厚，部分區域肺泡腔內充滿纖維素性滲出物，其中混有嗜中性粒細胞和脫落的肺泡上皮細胞，支氣管腔內充滿嗜中性粒細胞。根據剖檢結果，初步診斷為豬藍耳病與副豬嗜血桿菌病混合感染。

2.2 RT-PCR/PCR檢測

圖5 CSFV、PRRSV、PRVgE和PCV2核酸電泳圖

結果顯示豬藍耳病病毒為陽性，豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒及圓環病豬均為陰性。

2.3 細菌分離鑒定

結果發現，培養基上長出光滑無色呈針尖大小菌落，符合副豬嗜血桿菌特點。分子生物學檢測結果顯示肝肺綜合征HPS條帶為陽性。

2.4 藥敏試驗

結果顯示所分離嗜血桿菌對恩諾沙星、林可霉素及大觀霉素敏感，對磷霉素、新霉素、頭孢喹肟、粘桿菌素中介，對阿莫西林、氟苯尼考、環丙沙星抗生素耐藥。

3 討論

基于診斷結果采取了以下綜合防控措施：將發病豬群進行隔離，進行帶豬噴淋消毒，對豬圈清掃消毒；在飼料中添加抗病毒藥物（黃芪多糖）及抗生素（林可霉素和泰萬菌素）。經治療最終只死亡了7頭豬，疫情得到有效控制。

目前我國控制傳染病仍要堅持防大于治的原則，為此筆者協助豬場制定了嚴格的生物安全措施，通過血清抗體水平檢測，評估了各豬群豬藍耳病免疫水平及感染狀態，調整優化了免疫程序[7]。并制定了斷奶保育仔豬的藥物預防程序：即斷奶后1～5 d，阿莫西林飲水或拌料；斷奶后11～15 d，氟苯尼考飲水或拌料；斷奶后21～25 d，強力霉素飲水或拌料。