2株犬源沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析

李瑞波，張紅波

（1.泰安市理德動物醫(yī)院有限公司，山東 泰安 271000；2.山東省威海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，山東 威海）

沙門菌屬于革蘭氏陰性菌，呈細(xì)長桿菌，多單個存在，偶見兩個或多個連在一起，不形成芽孢、無莢膜[1]。隨著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，寵物的飼養(yǎng)數(shù)量不斷攀升，在一定程度上提高了沙門菌由寵物-人類的傳播風(fēng)險[2-3]。在寵物臨床中，抗生素的不合理使用甚至濫用，造成耐藥沙門菌的產(chǎn)生，且日趨嚴(yán)重[4]。超廣譜β內(nèi)酰胺酶是由細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的一類酶，可導(dǎo)致細(xì)菌對頭孢菌素類、單酰胺類及青霉素類抗生素耐藥[5]。

近年來我國科研工作者對細(xì)菌耐藥性及傳播機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，主要集中在食源性沙門菌[6]。關(guān)于寵物源沙門菌的資料較少。因此，本研究旨在了解泰安市寵物源沙門菌的分離情況、耐藥表型與ESBLs等耐藥基因的攜帶情況，以期為臨床寵物沙門菌病用藥提供科學(xué)依據(jù)，同時為人感染寵物源耐藥沙門菌提供預(yù)警。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 在2020年10月到2021年3月在泰安市某3家寵物醫(yī)院隨機(jī)采樣，共采集犬貓肛拭子84份，包括犬58份（69.05 %），腹瀉犬為23份（39.66 %），非腹瀉犬為35份（60.34 %）。貓26份（30.95 %），包括腹瀉貓15份（57.69 %），非腹瀉貓為11份（42.31 %）。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CVCC 3377）、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株（ATCC25922）均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 培養(yǎng)基 緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、四硫磺酸鹽煌綠增菌液（TTB）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、半固體營養(yǎng)瓊脂（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基（OXOID,England）。

1.1.4 試劑及試劑盒 ESBLs測定盒（杭州市濱和微生物試劑有限公司）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京市天根生化科技有限公司）、沙門菌血清型測定盒（天潤生物藥業(yè)有限公司）、瓊脂糖凝膠（agarose）、TAE緩沖液（北京康為世紀(jì)科技有限公司）、2×Taq Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）、核酸染料DuRed（北京泛博生物化學(xué)有限公司），試驗所需的去離子水與蒸餾水均由實(shí)驗室制備。

1.1.5 藥物 復(fù)方新諾明、四環(huán)素、多粘菌素B、氟苯尼考、慶大霉素、紅霉素、美羅培南、氨芐西林、恩諾沙星、頭孢曲松、阿莫西林、多西環(huán)素、頭孢氨芐、頭孢吡肟藥敏紙片（杭州濱和微生物試劑有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 沙門菌的分離與培養(yǎng) 將采集的肛拭子置于裝有4.5 ml的BPW的無菌搖管中，編號，之后放入搖床中37 ℃、220 rpm培養(yǎng)8～12 h。輕輕晃動培養(yǎng)的樣品混合物，待混勻后吸取0.5 ml，分別轉(zhuǎn)入裝有4.5 ml的SC增菌液和TTB增菌液的搖管中，放在搖床中37 ℃、220 rpm培養(yǎng)18～24 h。用無菌的接種環(huán)分別蘸取SC和TTB增菌液，劃線接種于XLD培養(yǎng)基，在37 ℃ 條件下培養(yǎng)24～48 h。

1.2.2 菌株鑒定 （1）微生物質(zhì)譜鑒定挑取疑似沙門菌的黑色單菌落進(jìn)行微生物質(zhì)譜鑒定，對鑒定結(jié)果為沙門菌的菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)。（2）PCR鑒定按照試劑說明書提取細(xì)菌基因組DNA，利用PCR擴(kuò)增固有基因FimW進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列（F：AACAGTCACTTTGAGCA TGGGTT；R: GAGTGACTTTGTCTGCTCTTC A），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增體系共25 μl；MIX 12.5 μl、DNA模板1 μl、上下游引物各1 μl、ddH2O 9.5 μl。反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min（預(yù)變性），94 ℃ 1 min，50 ℃1 min，72 ℃ 1 min，共25個循環(huán)，72 ℃ 10 min（延伸）。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 % 瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 沙門菌的血清型鑒定 根據(jù)沙門菌血清型測定盒的說明，分別進(jìn)行菌體抗原和鞭毛抗原的檢測。之后對比沙門菌抗原表確定被檢沙門菌菌株的血清型。

1.2.4 藥物敏感性試驗 采用K-B藥敏紙片法對寵物源沙門菌分離株進(jìn)行抗生素敏感性檢測。按照美國臨床和實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2016版[7]執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，判定結(jié)果為耐藥（Resistance,R）、中介（Intermediate, I）或敏感（Susceptible,S）。大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.5 ESBLs表型檢測 將分離株按0.5麥?zhǔn)蠞舛染鶆蛲坎嫉組H瓊脂平板上進(jìn)行ESBLs初篩與確證試驗，具體操作按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC 25922。

1.2.6 耐藥基因檢測 利用提取的DNA，參照GenBank中耐藥基因的序列及文獻(xiàn)[9-11]，合成18對引物，分別擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺類（blaSHV,blaOXA,blaCTX-M,blaTEM,blaPSE）、氨基糖苷類（aaC1,aaC2,aaC4,aaC3）、喹諾酮類（aac (6 ′)-Ibcr,qnrB,qnrA,qnrC,qnrD,oqxA,qnrS）、四環(huán)素類（tetA,tetB），以雙蒸水做為陰性對照，沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CVCC3377）作為陽性對照。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及退火溫度見表1。

表1 耐藥基因引物及退火溫度

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株的培養(yǎng)特征

XLD培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈現(xiàn)表面光滑凸出的黑芯菌落、邊緣整齊、周圍有一圈透明帶（圖1），判定為疑似沙門菌。

圖1 分離株在XLD培養(yǎng)基上的生長

2.2 寵物源沙門菌分離鑒定結(jié)果

微生物質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果均顯示，從84份寵物犬、貓樣品中分離到2株沙門菌，沙門菌的分離率為2.38 %。其中在35份健康的犬肛拭子中分離到2株為沙門菌，在23份腹瀉犬和26份貓肛拭子樣品中沒有分離到沙門菌。微生物質(zhì)譜鑒定結(jié)果見圖2。

圖2 分離菌株質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.3 血清型鑒定結(jié)果

血清型結(jié)果顯示1種沙門菌血清型，2株分離株（Y1、Y2）均為腸炎沙門菌。

2.4 藥物敏感性結(jié)果

2株沙門菌對復(fù)方新諾明、多粘菌素B、氟苯尼考、慶大霉素、美羅培南、氨芐西林、恩諾沙星、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢吡肟均表現(xiàn)為敏感。Y1對四環(huán)素和多西環(huán)素表現(xiàn)為中介，Y2對四環(huán)素、多西環(huán)素、頭孢曲松表現(xiàn)為中介。2株沙門菌均對紅霉素耐藥（表2）。

表2 2株犬源沙門菌分離株對14種抗生素的耐藥情況

2.5 ESBLs表型結(jié)果

產(chǎn)ESBLs初篩和確證實(shí)驗顯示，2株沙門菌均不產(chǎn)生ESBLs。

2.6 耐藥基因結(jié)果

對2株沙門菌進(jìn)行4類18種耐藥基因檢測，共檢測到3類5種耐藥基因。Y2菌株檢測到β-內(nèi)酰胺類中的blaCTX-M基因，氨基糖苷類中的aaC4基因，喹諾酮類中的qnrA，oqxA，aac(6 ′)-Ib- cr基因，四環(huán)素類基因中的tetA,tetB均未檢測到。值得注意的是，Y1菌株不攜帶此18種耐藥基因（表3）。

表3 2株沙門菌的血清型和耐藥基因檢測結(jié)果

3 討論

沙門菌是一種重要的人獸共患病原菌，全世界目前已發(fā)現(xiàn)3 000多種血清型[12]。寵物作為沙門菌的重要宿主之一，其對人類健康的威脅也應(yīng)該引起重視。特別是近年來寵物犬貓的飼養(yǎng)量不斷增加，犬貓和人類的關(guān)系密切，共處家居環(huán)境，使寵物源沙門菌對公共衛(wèi)生的影響不容忽視[13]。

細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的原因較為復(fù)雜，可能會由于耐藥基因的水平傳播而攜帶耐藥性。本研究從表觀健康犬中分離到2株腸炎沙門菌。對2株腸炎沙門菌進(jìn)行耐藥表型和產(chǎn)ESBLs表型試驗的結(jié)果顯示，2株沙門菌的耐藥譜相同，且均不產(chǎn)生ESBLs，提示這2株分離株具有相同或相近的來源。然而耐藥基因結(jié)果顯示，1株分離株攜帶3類5種不同耐藥基因，1株分離株18種耐藥基因檢測結(jié)果均為陰性，這可能是由于不同環(huán)境、不同時間，耐藥基因的流行和分布情況存在差異，同時，耐藥基因的遺傳特性、細(xì)菌耐藥情況、不同耐藥基因之間的相互作用等均可能會影響沙門菌對抗生素的耐藥性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的分離株未檢測到相關(guān)耐藥基因，而攜帶耐藥基因的沙門菌不一定對此類抗生素耐藥，具體結(jié)果有待于進(jìn)一步研究。本研究從84份犬、貓樣品中分離到2株腸炎沙門菌，看似表觀健康的犬，存在沙門菌感染情況，提示需要重視寵物來源人獸共患病原菌所帶來的的潛在風(fēng)險。