腐敗梭菌膠體金試紙條檢測方法的建立及類毒素疫苗的制備和應用

翁鴻宇，王秀媛，沈志強，宋松林，廉 維，柴同杰，韋良孟

（1.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州；3.吉林正業生物制品股份有限公司，吉林 吉林）

腐敗梭菌是一類可形成芽孢的革蘭氏陽性厭氧桿菌，可以產生芽孢，可在許多不同的環境中發現，主要感染人類和動物，該菌產生強大的外毒素，導致迅速和潛在的致命疾病[1]，造成無數人傷亡和每年數十億美元的農業損失[2]。而在羊快疫診斷方面，存在基層缺乏診斷技術試劑、診斷不及時等問題，以至在動物發病之前無法采取針對性治療措施；在疾病防制方面，存在疫苗有效抗原成分較低，免疫效果不理想等問題[3]。針對以上問題，本研究探索了更合適、更高效的腐敗梭菌增菌和產毒培養基和技術方法，以建立一種能夠快速診斷腐敗梭菌病的膠體金試紙條，并制備安全有效的腐敗梭菌類毒素疫苗，為羊快疫的早期診斷和預防提供理論借鑒和技術儲備。以期降低因羊快疫的暴發而造成的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料

腐敗梭菌參考株ATCC 12464購自美國菌種保藏中心；腦心浸液培養基（BHI）、厭氣肉肝湯培養基采購自青島海博生物技術有限公司；羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP采購自杭州華安生物公司；腐敗梭菌特異性引物合成自青島擎科梓熙生物科技有限公司。未免疫的40 kg左右綿羊（腐敗梭菌抗體陰性）購自泰安市下旺村羊場；3～4周齡的健康雌性昆明小鼠購自濟南朋悅實驗動物有限公司；日本大白兔購自武漢市萬千佳興生物科技有限公司；臨床樣本（1～6號）血清采集于青海牧區羊快疫發病羊群；陰性樣本血清采集于泰安市下旺村羊場健康羊群；豚鼠血清為本實驗室保存。實驗動物的使用和操作按照實驗動物福利的相應要求進行。

1.2 方法

1.2.1 腐敗梭菌培養條件的摸索 設置3組實驗環境，分別設置不同培養基、不同氣體環境以及不同培養基pH，放置于培養箱中，37 ℃，震蕩培養24 h后取出，將3組各取20 μl進行革蘭氏染色鏡檢，并測量各菌液在波長600 nm下的OD值。

1.2.2 腐敗梭菌膠體金試紙條檢測方法的建立（1）腐敗梭菌多克隆抗體的制備。①總蛋白的獲取及鑒定。對腐敗梭菌培養物進行菌液PCR擴增和凝膠電泳鑒定。于剩余菌液中加入0.4 % 的甲醛，在37℃溫箱中震蕩48 h，取出后8 000 rpm離心20 min，棄去上清，將沉淀用100 ml PBS充分旋起，重復離心，去除外毒素成分，獲得滅活后的抗原，進行SDS-PAGE鑒定，觀察到目的條帶。②多克隆抗體免疫兔。取2只健康日本大耳白兔子，取500 mg抗原與弗氏完全佐劑混合后進行皮下注射，免疫2～3周，二免三免時取300 mg抗原與弗氏不完全佐劑混合，對一免兔子進行皮下注射反應2周，四免時反應時間縮短為1周，其余處理不做改變。③純化后抗體效價檢測。取四免后的血清，將抗體進行親和層析純化，將純化后的抗體進行SDS-PAGE質控分析，測定抗體濃度，并通過間接ELISA檢測純化后抗體效價。（2）腐敗梭菌膠體金試紙條的制備。①膠體金溶液最適pH與最佳標記量的確定。首先用膠體金梯度法確定抗體與膠體金結合的最適pH，再使用純化水將腐敗梭菌抗體稀釋成1 mg/ml，把稀釋液各取0、5、10、20、30、40、60、80 μl，按順序加入8個1 ml裝有最適pH膠體金溶液的小試管中混勻，室溫靜置1～2 h，觀察結果，確定最佳標記量。②膠體金-抗體結合物的制備。將最適pH膠體金溶液20 ml加入腐敗梭菌抗體中，在室溫下攪拌30 min后，加入10 % BSA 2 ml或者10 % 聚乙二醇（MW 20 000）0.2 ml于其中，室溫攪拌10 min，9 000～11 000 rpm離心40～60 min，棄去上清，沉淀溶于2 ml膠體金－抗體保存液中，過濾得膠體金－抗體結合物原液。使用梯度稀釋法確定結合物原液工作濃度。③金標墊的制備及點膜。根據模具制備金標墊。最后，建立檢測線（T線）及質控線（C線）后，用劃膜機在NC膜上點膜。

1.2.3 腐敗梭菌膠體金試紙條的檢測試驗（1）靈敏性檢測。隨機抽取4支膠體金試紙條，分別向加樣孔中滴加約100 μl的PBS、陰性樣本稀釋液、陽性樣本2倍和6倍稀釋液，室溫下反應10 min。觀察結果反應是否靈敏。（2）特異性檢測。分別取實驗室保存的感染腐敗梭菌豚鼠血清，感染諾維氏梭菌豚鼠血清和健康豚鼠血清分別進行PCR鑒定。取各血清100 μl，滴加至膠體金試紙條點樣孔，室溫下反應10 min，觀察對腐敗梭菌的鑒定的特異性。（3）重復性檢測。用不同批次試紙條重復上述試驗，觀察結果是否存在差異。

1.2.4 腐敗梭菌類毒素疫苗的制備 （1）腐敗梭菌外毒素的獲取及小鼠最小致死量（MLD）的測定。將本實驗室制備的腐敗梭菌菌液，8 000 rpm離心20 min，棄去沉淀，將上清過濾除菌，加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4 ℃靜置過夜，取出產物使用8 000 rpm離心20 min，棄去上清，沉淀溶解于100 ml Tris-Hcl中。通過SDS-PAGE進行驗證。取5組健康昆明小鼠，每只腹腔注射0.5 ml使用生理鹽水倍比稀釋的腐敗梭菌外毒素。觀察小鼠在48h內的死亡情況，使組內全部小鼠死亡的最大稀釋倍數為腐敗梭菌外毒素的小鼠最小致死量（《中華人民共和國獸藥典》第3版）。（2）外毒素的滅活及檢驗。將粗提的外毒素平均分為3份，分別加入不同體積甲醛，37 ℃ 搖床震蕩滅活。過程中，每隔24 h腹腔注射3只小鼠，1 ml/只，3只小鼠均不死亡即滅活完全。（3）白油佐劑類毒素疫苗的制備及檢驗。疫苗水相：在已經滅活完全的類毒素溶液中按照5 %的比例加入tween-20震蕩混勻；油相：將Span-80和白油以94:6的體積比進行混合，再在Span-80和白油的混合溶液中加入硬脂酸鋁使硬脂酸鋁的終濃度為2 %，搖晃混勻，放于121 ℃ 高壓滅菌鍋中滅菌15 min。水相與油相以1:1.5的比例在組織切割機內進行充分乳化。按《中華人民共和國生物制品規程》檢驗合格，放置于4 ℃ 保存。

1.2.5 腐敗梭菌類毒素疫苗免疫保護性試驗（1）類毒素疫苗免疫小鼠攻毒試驗。準備3組9只3～4周齡的健康昆明小鼠，A組、B組內小鼠分別腿部肌肉注射0.1 ml、0.2 ml腐敗梭菌類毒素疫苗，C組分別不做處理。21 d后，9只小鼠均腹腔注射1MLD腐敗梭菌外毒素。觀察記錄48 h內，小鼠的死亡情況。（2）類毒素疫苗免疫小鼠的抗體水平檢測。準備3組共18只3～4周齡的健康昆明小鼠，平均分組。A組、B組分別腿部肌肉注射0.1 ml、0.2 ml腐敗梭菌類毒素疫苗，C組不做處理。在免疫后的21 d和28 d，每組選取3只進行眼球采血，離心取血清。以腐敗梭菌外毒素為包被抗原，用間接ELISA的方法測定小鼠血清抗體水平。（3）小鼠中和試驗檢測綿羊血清抗體。取上述試驗中的B組第3周血清，2倍腐敗梭菌外毒素對小鼠的最小致死量（MLD）與0.2 ml，1:200，1:400，1:600，1:800倍稀釋的綿羊血清混合，用生理鹽水定容到1 ml，放于37 ℃ 溫箱孵育2 h，每個稀釋倍數腹腔注射5只小鼠各0.5 ml，觀察小鼠存活情況。記錄0.1 ml血清可中和的腐敗梭菌外毒素對小鼠的最小致死量。

2 結果與分析

2.1 腐敗梭菌培養條件摸索

設置3組實驗環境，分別設置不同培養基、不同氣體環境以及不同培養基pH，放置于培養箱中，37 ℃，震蕩培養24 h后取出，每管各取20 μl進行革蘭氏染色鏡檢，并測量各菌液在波長600 nm下的OD值。

如下圖所示，置于自制培養基培養、一定氣體比例、pH=7.8的培養環境中培養的腐敗梭菌菌液在波長600 nm下的OD值更大，培養效果更好。

圖1 腐敗梭菌在不同培養環境中的增菌情況

圖2 腐敗梭菌在不同pH中的增菌情況

2.2 腐敗梭菌膠體金試紙條的制備

2.2.1 腐敗梭菌菌體蛋白的獲取 （1）腐敗梭菌菌液PCR鑒定。將腐敗梭菌進行增菌培養，取少量菌液進行PCR擴增和凝膠電泳鑒定，結果如圖3所示，顯示出單一的大小為527 bp的目的條帶。

圖3 腐敗梭菌PCR擴增和凝膠電泳鑒定

（2）腐敗梭菌菌體蛋白檢測。將菌液濃縮，除去對于培養基和外毒素成分，將菌體超聲破碎并完全滅活。通過SDS-PAGE質控分析，結果如圖4所示：可以看到清晰的蛋白條帶，蛋白含量較高。

圖4 菌體蛋白SDS-PAGE分析

2.2.2 高免血清中抗體效價的檢測 取兔四免抗血清，進行抗體效價檢測，結果顯示所得到的抗血清中腐敗梭菌抗體效價為1:102 4000，可用于膠體金試紙條的制備。

2.2.3 純化后抗體檢測 將純化后的抗體進行SDS-PAGE質控，結果如下圖所示，純化后抗體濃度為10 mg/mL；并通過間接ELISA檢測純化后抗體效價，結果顯示所制備的多克隆抗體靈敏度良好。

圖5 多克隆抗體純化SDS-PAGE分析

2.2.4 抗體標記最適pH與最佳標記量的選擇用膠體金梯度法確定抗體與膠體金結合的最適pH。當pH小于8.0時，膠體金溶液會隨著反應的進行無法保持紅色，而pH為8.0時，膠體金溶液保持紅色。由此可確定腐敗梭菌抗體與膠體金結合的最適pH為8.0。

采用蛋白梯度法確定腐敗梭菌抗體與膠體金結合的最適濃度。對照組和5 μg組呈現由紅變藍的聚沉現象，而從抗體大于10 μg組時管中保持紅色不變。由此可知10 μg為膠體金液由紅變藍的交界管。因此，腐敗梭菌抗體穩定1 ml膠體金所需的最適抗體量為10 μg/ml。

圖6 膠體金標記最適pH

圖7 抗體最適標記量

2.2.5 確定結合物原液工作濃度的和制備金標墊用工作液將膠體金－抗體結合物原液按1:2、1:4、1:8、1:16進行稀釋，取1.4 ml膠體金－抗體結合物稀釋液，均勻地加在玻璃纖維膜上，置37 ℃烤干，即為金標墊，測試后確定膠體金標記抗體的最適工作濃度。

2.2.6 膠體金探針的制備和純化 在1 ml膠體金－抗體結合物溶液中加入10 % NaCl水溶液1 ml后，溶液仍為無沉淀的紫紅色液體，說明制得的膠體金－抗體結合物原液具有良好的穩定性。

2.2.7 檢測線（T線）及質控線（C線）條件的建立和優化 對NC膜上T線及C線的包被抗體設置幾個濃度梯度進行試驗。結果表明，檢測顯色效果最優的一組濃度：腐敗梭菌抗體（T線上）工作濃度為1.5 mg/ml，羊抗兔IgG抗體（C線上）工作濃度為1 mg/ml。

2.2.8 腐敗梭菌膠體金試紙條的檢測結果 對本研究所制備的腐敗梭菌膠體金試紙條進行靈敏性檢測、特異性檢測、重復性檢測，結果顯示為明顯的陽性反應，而這與血清PCR反應結果相一致。由此說明，此膠體金試紙條靈敏性、特異性良好。

圖8 腐敗梭菌外毒素的SDS-PAGE鑒定

2.3 腐敗梭菌類毒素疫苗的制備

2.3.1 腐敗梭菌外毒素的鑒定 將腐敗梭菌進行增菌及產毒培養后，過濾除菌，用飽和硫酸銨進行粗提，靜置過夜后，沉淀溶解于Tris-Hcl中。即得到腐敗梭菌外毒素，通過SDS-PAGE分析，可看到46kDa處有明顯的蛋白條帶，且與腐敗梭菌α毒素條帶大小相吻合。

2.3.2 小鼠致死量（MLD）的測定 取已粗提純的腐敗梭菌外毒素，將50倍、100倍、200倍和400倍稀釋液和生理鹽水分別腹腔注射5組健康昆明小鼠，每組5只各0.5 ml。使本組內小鼠全部死亡的最大稀釋倍數為此外毒素對于小鼠的最小致死量（《中華人民共和國獸藥典》第3版）。結果如表2，腐敗梭菌粗提外毒素的最小致死量為5 μl。

表2 外毒素小鼠最小致死量測定結果

2.3.3 外毒素的滅活和檢驗 將粗提的外毒素平均分為3份，分別加入甲醛，使其終濃度為0.3 %、0.4 %、0.5 %，置于37 ℃ 搖床中震蕩滅活，每隔24 h腹腔注射3只小鼠，1 ml/只。如表3所示，甲醛最佳滅活濃度為0.4 %，最佳滅活時間為72 h。

表3 不同濃度甲醛滅活時間

2.3.4 腐敗梭菌類毒素疫苗的安全檢驗 制備的腐敗梭菌類毒素疫苗無菌檢驗，甲醛、硫柳汞殘留量檢驗，均符合《中華人民共和國獸用生物制品》要求。安全性檢驗中，家兔無異常情況，無肉芽或潰瘍產生。

2.3.5 疫苗免疫效果的初步檢測 （1）類毒素疫苗免疫小鼠攻毒試驗。將9只3-4周齡的健康昆明小鼠，分為3組，A組、B組分別腿部肌肉注射0.1 ml、0.2 ml腐敗梭菌類毒素疫苗，C組分別不做處理。正常飼喂21 d后，9只小鼠均腹腔注射1MLD腐敗梭菌毒素，觀察記錄死亡情況。結果如表4所示，C組小鼠全部死亡說明，腐敗梭菌類毒素疫苗對試驗小鼠起到的一定的免疫保護作用。

表4 不同接種劑量下小鼠攻毒試驗結果

（2）類毒素疫苗免疫小鼠的抗體水平檢測。用間接ELISA方法檢測抗體水平，并取平均值。結果如表5所示，在免疫后的21 d，2個接種劑量下的小鼠抗體效價均為1:6 400；而免疫后的28 d，免疫0.2 ml組的小鼠血清抗體效價下降。

表5 不同免疫劑量下的小鼠抗體水平

2.3.6 小鼠中和試驗檢測抗體 取上述試驗中的綿羊3.5 ml組第3周血清，2倍腐敗梭菌外毒素對小鼠的最小致死量（MLD）與0.2 ml，1:200，1:400，1:600，1:800倍稀釋的綿羊血清混合，用生理鹽水定容到1 ml，放于37 ℃ 溫箱孵育2 h，每個稀釋倍數腹腔注射注射小鼠5只各0.5 ml，觀察小鼠存活情況。小鼠全部存活的血清最大稀釋倍數即為0.1 ml血清可中和多少小鼠的最小致死量。結果如表6所示，當血清稀釋比為1:600時，小鼠全部存活；稀釋比為1:800時3只小鼠死亡。因此0.1 ml血清能中和600個小鼠最小致死量的毒素。

表6 綿羊血清抗體小鼠中和試驗結果

3 討論與結論

羊快疫由腐敗梭菌引起，發病急、致死快且臨床癥狀不典型。目前，我國通常接種梭菌聯苗進行預防，出現典型癥狀時采用耗時較長的傳統的診斷方法往進行檢測，導致羊群不能得到及時治療大面積感染。基于以上原因，本研究首次成功建立了腐敗梭菌膠體金快速診斷方法。本研究通過將腐敗梭菌菌體蛋白質控分析發現其成分較為單一，可用于多克隆抗體的制備。由于腐敗梭菌為革蘭氏陽性菌，細胞壁多層較厚，且在體液免疫過程中菌體會在酶的作用下裂解，本研究中參考了鞠文等人方法進行菌體蛋白處理[4]，并利用改進的腐敗梭菌培養方法制備了有效抗原成分較高的腐敗梭菌類疫苗。能夠針對性的預防羊快疫，高效、便捷的及時做出疾病診斷，填補我國現有腐敗梭菌病診斷技術的空白。

本研究成功制備了高效腐敗梭菌抗血清，抗體效價達到1:1024000，經純化獲得腐敗梭菌多克隆抗體，抗體最適標記量為10 μg/ml，從而建立腐敗梭菌膠體金快速檢測方法。經檢測，此方法特異性強，靈敏度高，臨床診斷符合預期效果。首次創新性地制備了腐敗梭菌外毒素，并制備腐敗梭菌白油佐劑類毒素疫苗。此疫苗免疫小鼠21 d后，血清中抗體效價達到1:6 400。免疫綿羊第21 d抗體水平達到最高，并持續到第6周。確定參考免疫劑量為3.5 ml，且免疫21 d后，血清小鼠中和效價為1:600。初步說明此疫苗免疫效果良好，具備良好的臨床應用前景。

本研究建立的腐敗梭菌膠體金層析技術用于疾病診斷具有高效、便捷、靈敏度高等優點，將此技術應用于腐敗梭菌病的診斷，可填補我國現有腐敗梭菌病診斷技術的空白。同時，在我國牧區，羊只接種梭菌聯苗后發生羊快疫的事件屢有報道，目前市面上所銷售的針對于羊快疫的疫苗多為梭菌三聯或四聯滅活疫苗，在疫苗的制備過程中基本使用菌液作為免疫原，彭小兵等人的研究發現其檢驗合格率較低，且其研究表明毒素的含量是影響免疫效果的重要原因，因此，本研究所制備的腐敗梭菌類毒素疫苗對于防治羊快疫至關重要。