油茶籽油加工過程中蛋白含量的變化研究

劉本同，秦玉川，王麗玲，黃旭波，童曉青，方 茹， 賀 亮，程俊文，王衍彬，楊 柳

(浙江省林業科學研究院森林食品所,杭州 310023)

油茶屬山茶科油茶屬植物，是中國傳統的木本油料作物之一，也是我國大力發展的山地木本食用油原料，截止2020年，國內栽培面積突破7 000萬畝。從油茶種子中獲取的油茶籽油，因其產地環保、脂肪酸組成合理、富含健康因子等優點而備愛關注，逐漸成為消費級高端木本食用油的代表，2020年全國油茶籽油產量突破80萬t，產值超過1 000億元，成為中國食用油的重要組成之一。

蛋白廣泛存在于油料植物種子中，也是油體膜層的主要組成部分[1]，在食用油的生產過程中，部分蛋白質會在壓榨、浸提等加工過程中因壓力等原因被帶入到油脂中，但因為油脂中蛋白含量一般非常微量而未受重視，通常認為油脂中的少量蛋白會在脫膠等精煉過程中除去[2]。但也有研究表明，精煉工藝并不能完全消除蛋白組分[3]，植物油中的微量蛋白質不僅會對油脂貯存穩定性造成影響[4]，還可能會引起一些不良過敏反應[5]

壓榨與浸提是常用的食用油制取工藝，壓榨工藝制取的油茶籽油感官品質、理化指標與儲藏品質較優，但出油率較浸提工藝低；浸提工藝出油率高[6]，但油的感官品質和耐貯性等指標較壓榨油差，并可能存在溶劑殘留與苯并(α)芘超標的風險[7]。由于市場上壓榨與浸提油茶籽油價格差異較大，在實際生產中，浸提油茶籽油一般由壓榨餅粕浸提所得，原料貯藏條件無法控制，更是加大了產品中苯并(α)芘、塑化劑、黃曲霉毒素污染的風險[8-10]。

對油茶籽油是否為浸提的判斷，一般是根據GB 5009.262—2016《食品中溶劑殘留量》進行溶劑殘留檢測，經樣品準備、頂空平衡、氣相色譜分析，每個樣品耗時超過1 h。而且，檢出限僅為2 mg/kg，現有的高真空脫臭技術可以較容易地達到這一目標。巨大的經濟利益與油脂脫溶劑技術的進步，導致市場上使用或添加浸提油茶籽油冒充壓榨油茶籽油的現象層出不窮。

離子液體-鹽離子組成的雙水相體系(ABS)是近年來發展起來的一種新型分離純化技術[11-13]，雙水相體系在生物大分子的分離和提取方面具有獨特的優勢[12, 14]，而離子液體與雙水相體系作為環境友好型萃取體系的優勢相得益彰，并能有效地解決傳統聚合物-聚合物或聚合物-鹽雙水相體系極性不可調造成萃取效率低下的問題[13]。目前離子液體-鹽雙水相體系在提取蛋白方面得到了廣泛的應用。Belchior等[14]利用生物相容性的四烷基類離子液體與K2HPO4/KH2PO4/K3PO4組成的雙水相體系成功萃取了卵清蛋白和溶菌酶，并進一步從離子液體富集相中回收了蛋白，回收率達到99%。Han等[15]利用金屬螯合離子液體雙水相浮選體系并結合兩步沉淀法從菠蘿中成功提取了菠蘿蛋白酶。離子液體具有幾乎不揮發、不可燃、溶解性能優異、結構可設計等特點[16, 17]，因此與傳統蛋白提取方法相比，離子液體-鹽雙水相體系提取蛋白具有環境友好、體系溫和等優點。

本研究針對油茶籽油精制的過程，考察過濾、脫膠、堿煉、脫色、脫臭、冬化等工藝過程中所得到的食用油，借助咪唑類離子液體-碳酸鉀雙水相萃取法獲得油中的殘留蛋白，分析蛋白含量及性質的變化，探明蛋白含量變化與油脂加工過程的相關性，為加工技術改進提供思路，并探討了利用油中蛋白含量作為鑒別壓榨與浸提油茶籽油方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶籽、BCA蛋白檢測試劑盒、[Bmim]Cl；磷酸鉀、氫氧化鈉、氯化鈉：分析純；白土、硅酸鎂：食品級。

Lab Dancer振蕩器，Multiskan酶標儀，ZS90粒度分析儀，SSYZ30A雙螺桿壓榨機。

1.2 方法

1.2.1 油茶籽油處理方法

壓榨方法：油茶籽干燥至含水率6%～8%，脫殼粉碎，輸送至雙螺桿壓榨機壓榨，壓榨油過60目濾袋初濾，為壓榨油；

過濾方法：壓榨油過200目濾袋精濾；

精煉方法：壓榨過濾后的油茶籽毛油經水化脫膠、堿煉、水洗、脫色、脫臭、冬化，制得成品油茶籽油(圖1)，具體工藝參數為：

脫膠油制備：過濾毛油攪拌升溫至75 ℃，緩慢加入同溫油質量0.8%～1.2%的純凈水，45 r/min攪拌15 min，靜置分離，得到脫膠油。

堿煉脫酸：將脫膠油加熱至80 ℃，加入玻美度4°同溫堿液，60 r/min攪拌50 min，再降至30 r/min攪拌15 min，攪拌過程中升溫至95 ℃。靜置分層，獲得堿煉油；堿煉油加入同溫油質量10%的1.5%氯化鈉水溶液，攪拌洗滌，靜置分層，獲得水洗1次油；同樣方法重復水洗1遍，獲得水洗2遍油。

吸附脫色：將堿煉脫酸水洗2遍后的油，加入1.5%的白土和0.5%的硅酸鎂，攪拌加溫至95 ℃，繼續攪拌30 min，真空過濾，獲得脫色油。

真空脫臭：將脫色油加入脫臭罐中，于180 ℃，1.0 kPa真空度下脫臭30 min，降溫，獲得脫臭油。

冬化：將脫臭油，降溫至40 ℃左右，加入到冬化罐中，10～15 r/min攪拌，分級冷卻至4～6 ℃，養晶72 h，0.35 MPa過濾，獲得成品油。

圖1 油茶籽油精制工藝簡化圖

1.2.2 離子液體雙水相體系相圖測定

采用濁點法測定25 ℃條件下離子液體雙水相體系的相圖。首先稱取一定量的離子液體溶于0.5 g水中，加入一定量的鹽至體系渾濁，精確記錄加入的鹽和離子液體質量，向混合液中滴加純凈水至體系澄清，精確記錄加入水的量，隨后加入一定量的鹽至體系再次渾濁，精確記錄加入的鹽的質量，重復滴加純凈水及鹽的步驟，直至收集足夠數據。

1.2.3 雙水相提取油茶籽油蛋白

將一定量的油茶籽油加入到離子液體和鹽形成的雙水相中。以離子液體和鹽的濃度為研究對象，通過式(1)計算提取效率。

(1)

1.2.4 蛋白測定方法

采用BCA法測定蛋白質含量，測定方法參照BCA檢測試劑盒的使用說明。以牛血清白蛋白溶液為對照，繪制標準曲線。

1.2.5 油中非脂溶性顆粒測定方法

精確稱取油茶籽油樣品1.00 g加入到10 mL玻璃具塞試管中，加入2.0 mL高純水，振蕩1 min，靜置分層，棄去油相，再向試管中加入2 mL色譜純正己烷，振蕩30 s，靜置分層，棄去有機相，留水相備用。

吸取1.2 mL水相加入Zeta粒度電位儀樣品杯中進行粒徑測試。測試條件：粒徑模式，物料：蛋白，分散介質：水；溫度：25 ℃，平衡時間：120 s，測定次數：100次。

1.2.6 磷脂含量分析

按GB/T 5537—2008《糧油檢驗 磷脂含量的測定 第二法 質量法》測定。

1.2.7 數據分析

數據統計與制圖采用WPS2019和Python3.9。

2 結果與分析

2.1 [Bmin]Cl-K2CO3相圖繪制及濃度實驗

在目標成分的分離應用中，對雙水相的要求不僅要易形成，而且要有理想的提取效率。根據以往的研究，離子液體的提取性能取決于其對目標化合物的溶解能力，同時也可能受到離子液體本身或與被提取物結合產生的聚類現象的影響[18]，因此根據文獻中離子液體-鹽雙水相體系形成的特點[19,20]，本實驗選擇易于形成雙水相且對蛋白提取有良好效率的咪唑類離子液體[Bmin]Cl和碳酸鉀。由于雙水相體系不像普通的液液萃取體系可通過將預平衡后的兩相直接混合獲得較為合適的兩相比，需要根據具體分相情況判斷。因此為了探明兩者形成雙水相的濃度范圍，采用濁點法測定25 ℃條件下離子液體雙水相體系的相圖(圖2)，以形成的相曲線為分界，上方為兩相區，下方為均相區，并據此確定萃取體系的配比，并考察離子液體和鹽的濃度對提取效率的影響(圖3)確定用于后續油茶籽油蛋白的提取的[Bmin]Cl和碳酸鉀質量濃度分別為200、500 g/L。

圖2 25 ℃常壓下[Bmin]Cl + K2CO3+H2O形成雙水相圖

圖3 鹽濃度和IL濃度對蛋白提取性能的影響

2.2 蛋白含量測試方法學結果

圖4為油中蛋白測試方法，標準樣品測試結果與線性擬合結果，擬合方程為：y=0.7283+0.15198x，方程R2=0.985 74。同一樣品分成6組，采用1.2方法進行重復性和加標回收率試驗，結果表明，樣品蛋白質量分數平均值為(0.212 0±0.009 3)%，變異系數為4.39%，平均加標回收率為(80.95±0.05)%，說明本方法穩定性和精度較好，可以滿足研究需求。

圖4 油中蛋白含量測試標準樣品線性擬合

2.3 油茶籽油加工過程中蛋白含量的變化

圖5為油茶籽油從壓榨后的毛油，經過濾、脫膠、堿煉、脫色、脫臭、冬化等工藝制成成品油過程中，各工序油中蛋白含量的結果。t檢驗結果表明，過濾、脫膠、堿煉、脫色、冬化工藝均會明顯降低油中蛋白質的含量，處理前后蛋白含量差異極顯著，特別是壓榨毛油的過濾程序，油中蛋白降低了76.03%，降幅最大，其次為堿煉工藝和脫色工藝，油中蛋白質量分數分別降低了38.29%和31.41%，在毛油階段，蛋白、磷脂和碳水化合物等雜質含量較高，易于凝聚成團，200目濾袋可以有效的將包括蛋白在內的大部分雜質濾除，堿煉中添加堿水反應后的油水分離，脫色工藝中添加的多孔性助濾劑，均能有效降低蛋白等雜質的含量，油脂精煉工藝中蛋白含量的減少在大豆油精煉過程的中也得到了證實[21]。在精煉工藝中，堿煉后的水洗步驟、脫臭工藝對油中蛋白含量的影響較小，加工前后含量數據無顯著性差異。

注：*表示差異顯著性，P<0.01。圖5 不同工序油茶籽油蛋白含量

2.4 油茶籽油加工過程中非脂溶性顆粒物的變化

從圖6可以看出，在油茶籽油加工過程中，非脂溶性的顆粒物粒徑是逐漸變小的，這與油中蛋白質含量的變化趨勢是一致的，但油茶籽油中的顆粒物并非只有蛋白一種，還含有磷脂、淀粉與纖維等雜質。圖7展示了加工過程中蛋白含量、磷脂含量與非脂溶性顆粒物粒徑的變化，通過Pearson相關性分析發現，蛋白含量、磷脂含量與粒徑間呈極強的正相關性，相關系數分別為0.904 7和0.981 4(P<0.01)。

研究表明，含油種子中的油體為球形，內部為甘油三酯液滴，外層包裹了由磷脂和蛋白組成的膜[22]，油茶籽油體中發現8種蛋白，分子質量范圍在13～54 ku之間[23],以14.4、18.4 ku 2種蛋白為主[24]。油料種子在壓榨過程中，種仁破碎，種仁中的蛋白與油體膜中的蛋白和磷脂隨甘油三酯流出，在毛油階段，由于蛋白、磷脂等雜質和水分含量較高，這些雜質容易聚集成團，形成大顆粒，隨著脫膠、堿煉、水洗、脫色等精煉工藝的進行，顆粒性雜質大幅降低，其聚集速度變慢，這可能是所測非水溶性顆粒物尺寸隨精煉工藝的進行逐漸變小的原因之一。

圖6 油茶籽油加工過程中非脂溶性 顆粒物顆粒變化

圖7 油茶籽油加工過程中非脂溶性顆粒 大小、蛋白、磷脂含量變化圖

2.5 壓榨與浸提成品油茶籽油中蛋白含量的差異

本研究共收集到壓榨成品油茶籽油樣本16個，其中企業采樣6個，市場采購7個，實驗室自制3個，浸提成品油茶籽油樣本14個，其中企業采樣4個，市場采購7個，實驗室自制3個。30個樣本中蛋白含量結果見圖8。

圖8 壓榨與浸提成品油中蛋白含量差異

從圖8可以看出，壓榨成品油茶籽油中蛋白含量明顯高于浸提成品油茶籽油，壓榨油中蛋白含量范圍0.070 4～0.584 2 mg/g，浸提油中蛋白含量范圍0.000 1～0.058 2 mg/g，t檢驗結果表明，在0.01水平，兩組數據間存在極顯著性差異，表明壓榨成品油和浸提成品油中蛋白含量差異巨大。浸提法制油是利用相似相溶的原理將種子中的甘油三酯利用低極性有機溶劑從原料中溶解出來的方法，浸提成品油中蛋白含量較低，可能與種子中的蛋白在溶劑中的溶解性較差，以及浸提油基本上采用壓榨剩余餅粕做為溶劑浸提原料有關。油茶籽餅粕原料采購自不同地區不同壓榨企業，儲存環境各異，江南的多雨氣候導致原料含水率升高，微生物繁殖，殘油的水解和氧化現象嚴重。浸提原料的品質不高，且差異較大，使得浸提毛油品質差異巨大，不得不采用重度精煉工藝使其滿足食用植物油的衛生標準要求，這也導致了浸提成品油中微量蛋白的含量遠低于壓榨成品油。

鑒于市場上油茶籽油產品魚龍混雜，國標對浸提油鑒定的局限性，采用本研究方法進行油茶籽油中的蛋白含量測定，方法簡單快速，樣本量少，成本低，且采用酶標儀和96孔板單次可同時分析80個以上樣本，可以用于壓榨與浸提油茶籽油的初步篩檢。

3 討論

在油料作物種子中，蛋白、磷脂和甘油三酯組成了油體，制油過程，伴隨著油體的破碎，必然會有少量蛋白和磷脂隨著加工過程被帶入食用油中，影響著油脂的感觀、氣味、儲存性和加工特性等，部分食用油中的蛋白還可能帶來過敏風險。油脂加工的精煉過程，也是磷脂與蛋白等“不良”因子去除的過程。食用油中的蛋白質含量較少，提取與分析困難，本研究采用[Bmin]Cl+K2CO3雙水相體系對油茶籽油中的蛋白進行提取、分析，方法重復測試變異系數4.39%，平均加標回收率為(80.95±0.05)%，是一種可行的油脂蛋白含量測定方法。

利用本方法對油茶籽油加工過程研究發現，壓榨油茶籽油中蛋白含量可達2.0 mg/g以上，隨著過濾、脫膠、堿煉、脫色等加工工藝的進行，成品油中蛋白含量可降至0.2 mg/g以下，部分樣品低到0.000 1 mg/g。在這些加工過程中，過濾、脫膠、堿煉、脫色、冬化工序均能顯著降低油中蛋白含量，其中過濾工序最為明顯，蛋白含量減少76.03%。

通過對壓榨與浸提成品油茶籽油中的蛋白含量研究發現，浸提成品油茶籽油中的蛋白含量明顯低于壓榨成品油茶籽油，并具有極顯著差異。因原料與加工工藝的不同，市場上的壓榨油茶籽油與浸提油茶籽油價格至少差了一倍，這也導致了現在市場出現采用浸提油茶籽油冒充壓榨油的現象。本實驗采用的油脂中蛋白含量檢測方法，在效率和精度上，能夠滿足檢測的需求，利用蛋白含量對壓榨和浸提油茶籽油進行鑒別，具有極大的實際應用潛力。

4 結論

本實驗采用雙水相萃取技術研究油茶籽油中的蛋白，獲得油中的微量蛋白雙水相萃取體系，方法回歸決定系數R2=0.985 74，變異系數4.39%，加標回收率(80.95±0.05)%，是一種快速可行的油脂蛋白檢測方法，本實驗成品油中蛋白含量僅為壓榨毛油的3.32%。雖然油中蛋白含量受加工工序的影響較大，但相比于油中殘留溶劑的頂空-氣相色譜法，其低檢出限與快速、批量檢測能力等優點，使得利用油中蛋白含量作為壓榨與浸提油的鑒別指標成為可能。