響應面結合遺傳算法優化鷹嘴豆中抗炎活性成分的提取

牛華周, 康賀磊, 侯萬超, 劉春明, 李賽男, 張語遲, 劉 震

(長春師范大學中心實驗室1，長春 130032) (長春師范大學數學學院2，長春 130032)

鷹嘴豆(cicerarietinumL.)又名雞豆和桃豆等，是豆科鷹嘴豆屬植物鷹嘴豆的種子，在我國多個省份均有種植[1]，具有補中益氣、溫腎壯陽、主消渴之功效[2]。近年來，國內外對鷹嘴豆的生物活性研究多有報道，鷹嘴豆中所含的異黃酮類成分具有抗氧化和抑制Caco-2細胞生長等作用[3]，但是對于鷹嘴豆中抗炎活性的研究報道很少。而5-脂氧合酶對于炎癥的發生存在著密不可分的關系[4]，因此利用5-脂氧合酶對鷹嘴豆中抗炎活性成分進行初步研究，為從鷹嘴豆中分離抗炎活性成分提供一定的參考。

鷹嘴豆異黃酮提取工藝參數的優化是非線性的擬合過程，因此利用遺傳算法較為合適。遺傳算法是一種模擬自然進化過程的全局尋優算法[5]，在優化天然產物有效成分的提取條件中有著廣泛應用[6]。本實驗利用響應面對鷹嘴豆異黃酮提取過程中的超聲時間、乙醇濃度和料液比3個因素進行模擬推算，將響應面優化所得的擬合函數作為遺傳算法的適應性函數，在程序中進行個體評價、選擇運算、交叉運算以及變異運算。運行遺傳算法優化利用Matlab 2018b程序和程序附帶的GAOT工具箱完成[7]。

實驗以鷹嘴豆為研究對象，首先從單因素水平考察了提取條件對提取率的影響；其次，應用響應面結合遺傳算法優化鷹嘴豆異黃酮的提取方法；利用超濾-質譜技術對鷹嘴豆粗提中的化學成分進行抗炎活性成分篩選。應用液-質聯用技術對鷹嘴豆中抗炎活性成分進行初步鑒定。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

鷹嘴豆；5-脂氧合酶；乙腈(色譜級)；超濾離心管(100 ku)。

Waters 2695高效液相色譜儀，LCQ-Fleet超高效液相色譜-高分辨質譜聯用儀，DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋，KQ-400DE型超聲波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 超聲輔助提取工藝的優化

1.2.1.1 蘆丁標準品標準曲線的繪制

取5.12 mg蘆丁標準品用65%乙醇溶液溶解、定容于25.0 mL容量瓶中備用。分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL蘆丁標準品溶液，按照文獻[8]方法分別加入顯色劑，顯色10 min，采用紫外-可見分光光度計在510 nm測定不同濃度蘆丁標準溶液的吸光度，制作鷹嘴豆異黃酮濃度吸光度標準曲線。

1.2.1.2 鷹嘴豆的提取

鷹嘴豆粉碎后過100目篩，按料液比加入乙醇溶液，超聲提取，過濾后蒸干，用65%乙醇溶解，顯色，測定鷹嘴豆異黃酮含量。

1.2.1.3 單因素實驗

準確稱取粉碎后的鷹嘴豆5.0 g，采用超聲法提取鷹嘴豆異黃酮，分別考察了超聲時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)、乙醇體積分數(35.0%、45.0%、55.0%、65.0%、75.0%、85.0%、95.0%)和料液比(1∶10.0、1∶15.0、1∶20.0、1∶25.0、1∶30.0、1∶35.0、1∶40.0 g/mL)對鷹嘴豆異黃酮提取率的影響。

1.2.1.4 響應面實驗

依據單因素實驗結果，選取超聲時間(X1)、乙醇濃度(X2)和料液比(X3)為實驗因素，以異黃酮得率(Y)為響應值，利用Design-Expert中的Box-Behnken組合，進行3因素3水平的響應面實驗，實驗因素與水平設計如表1所示。

表1 實驗設計因素與水平

采用響應面分析法得到的二次回歸模型如式(1)所示。

(1)

式中：Xi和Xj為自變量，b0、bi、bii和bij分別為截距、線性回歸、二次項的回歸、各交互項的回歸的系數[9]。

1.2.1.5 遺傳算法設計優化

在MATLAB程序中，利用神經網絡工具箱對數據進行神經網絡建模。實驗創建的提取因素優化模型為3層ANN模型(輸入層、隱含層和輸出層)，輸入層作為自變量；輸出層給出因變量[10]。選擇超聲時間、乙醇濃度和料液比為自變量，鷹嘴豆異黃酮提取率為因變量，選擇輸入層3個神經元，輸出層1個神經元的網絡模型。經過多次訓練實驗，得到了最佳的神經網絡模型。采用優化得到的擬合函數，利用遺傳算法對輸入變量(超聲時間、乙醇濃度和料液比)進行優化，以使鷹嘴豆異黃酮提取率最大為目標。設置遺傳算法的搜索范圍大小為-1～1，優化得出全局優化解[11]。

圖1 超聲提取鷹嘴豆中異黃酮的ANN模型

1.2.2 超濾-質譜法篩選鷹嘴豆提取物中5-脂氧合酶抑制劑

200.0 μL的反應體系分別由100.0 μL Tris-HCl緩沖溶液、20.0 μL 300 mg/mL樣品溶液與80.0 μL不同濃度的5-脂氧合酶溶液(0、0.5、1.0和10 U/mL，pH 7.2～7.4)組成，將反應體系渦旋振蕩，混勻后37 ℃水浴孵育30 min，利用超濾膜(100 ku)分離與酶結合的復合物和未結合的小分子，分離時采用離心機在13 000 r/min的條件下離心10 min。加入100.0 μL Tris-HCl緩沖溶液沖洗超濾膜，沖洗未結合的小分子化合物，離心10 min，重復該操作3次。再加入100.0 μL 50%甲醇水(50∶50)溶液，釋放與5-脂氧合酶結合的活性小分子，離心10 min，重復步驟3次。將甲醇洗脫液合并，分析測定各活性成分的含量。空白對照組由緩沖溶液代替酶溶液，其他條件不變，重復實驗3次。活性成分與酶的結合能力以增強因子表示，計算公式為：

(2)

式中：A1為與5-脂氧合酶結合的活性小分子化合物的量；A2為未與5-脂氧合酶結合的小分子化合物初始的量[12]。

1.2.3 高效液相色譜以及質譜檢測條件

色譜柱為SunFireTMC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，I.D.5.0 μm)，檢測器：2998二極管陣列檢測器，流動相：水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度：0～10 min，3%～3% B；10～40 min，3%～65% B；40～60 min，65%～100% B，檢測波長：254 nm，進樣量：10.0 μL。

利用六通閥聯接質譜與液相色譜二極管陣列檢測器(DAD)，選擇大氣壓化學電離離子源(APCI)為質譜離子源，掃描范圍為150～4 000；采用正離子分析模式；離子阱壓力為3.10 × 107Pa；鞘氣輔助氣為高純度N2。液相色譜參數同上述高效液相色譜參數。

1.2.4 數據統計與分析

每組實驗重復3次，結果用“平均值±標準差”表示；采用Design-Expert軟件中Box-Behnken組合對實驗數據進行方差分析(ANOVA)；采用Matlab軟件優化超聲提取鷹嘴豆中異黃酮工藝參數；Design-Expert8.0.6軟件設計組合實驗以及繪制響應面圖形，利用Origin進行單因素實驗繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

超聲提取鷹嘴豆異黃酮的單因素實驗，結果如圖2所示。超聲時間在0～1.5 h內鷹嘴豆異黃酮提取率逐漸增加，超時時間大于1.5 h后提取率逐漸降低。提取時間為1.5 h時，鷹嘴豆異黃酮提取率達到最大值。由于超聲破壞了鷹嘴豆的細胞壁和細胞膜，導致鷹嘴豆細胞內異黃酮大量溶出，因此超聲時間越長，異黃酮的溶出率越高，隨提取時間的繼續增加，鷹嘴豆細胞組織中大量細胞破裂，其他雜質的溶出，影響鷹嘴豆異黃酮的溶出率[13]，因此最佳超聲時間為1.5 h。

鷹嘴豆異黃酮的提取率在乙醇體積分數為30%～70%時，隨著乙醇濃度的增加逐漸升高，當乙醇濃度大于80%時，提取率逐漸降低。該現象可能由于乙醇濃度增加，異黃酮的溶解度逐漸降低引起的。異黃酮一般易溶于高濃度有機溶劑，但異黃酮苷一般易溶于低濃度乙醇等有機溶劑。異黃酮苷在超聲提取條件下不易分解，因此在乙醇體積分數為35%～75%時，提取率逐漸增加，當乙醇濃度繼續增加時，將不利于鷹嘴豆中大量的異黃酮苷的溶出，因此提取率會降低[14]，因此最佳乙醇體積分數的為75%。

鷹嘴豆異黃酮提取率在料液比1∶10.0至1∶25.0 g/mL之間呈現逐漸增加的趨勢，是因為隨著料液比的增加，鷹嘴豆和溶劑之間的濃度差增加，加速異黃酮的溶出。當料液比大于1∶25.0時，乙醇體積過多時也可能造成其他物質的滲出，影響異黃酮的溶出[15]。因此最佳料液比為1∶25.0 g/mL。

圖2 超聲時間、乙醇體積分數、和料液比對異黃酮提取率的影響

2.2 響應面分析實驗結果

鷹嘴豆異黃酮的提取條件選取超聲時間、乙醇體積分數和料液比3個因素，根據Box-Behnken實驗原理，利用Design-Expert程序，設計三因素三水平的響應面實驗。利用響應面優化鷹嘴豆異黃酮的最佳提取條件，并擬合出相應的函數，結合神經網絡進行進一步優化。利用響應面擬合得到的函數為：

Y=0.74+0.04A+0.05B+0.02C+0.04AB-0.03BC-0.06A2-0.10B2-0.14C2

(3)

所選用的二次多項模型P<0.05，R2=0.92，說明該模型二次方程顯著，本方法可靠，對模擬分析三因素三水平實驗條件是可行的。并且f>0.05為模型項顯著。

2.3 遺傳算法優化實驗結果

利用 Matlab R2018b軟件中的遺傳算法優化工具箱，在響應面所構建的擬合函數的基礎上，以鷹嘴豆異黃酮提取率為遺傳算法的適應度函數。經過N迭代后，適應度函數值趨向適應度最高的個體[16]，即鷹嘴豆異黃酮提取率的最大值。由圖3可見，當迭代13次時，群體的適應性函數變化趨勢達到最大值0.76，即鷹嘴豆異黃酮提取率最大值為0.76 mg/g，此時超聲時間(X1)、乙醇體積分數(X2)、和料液比(X3)水平編碼分別為0.47、0.36和-0.02，即實驗水平分別為1.73 h、78.64%和1∶24.9 g/mL。在此條件下，提取鷹嘴豆中異黃酮的成分，所得異黃酮含量理論值為0.76 mg/g。響應面與遺傳算法相結合對鷹嘴豆最佳提取工藝進行優化，能較準確地優化鷹嘴豆異黃酮的最佳提取條件。

圖3 遺傳算法優化結果

2.4 超濾-質譜技術篩選鷹嘴豆5-脂氧合酶抑制劑

鷹嘴豆超濾實驗的空白對照組以及分別與80.0 μL不同濃度的5-脂氧合酶(0.5、1.0和10.0 U/mL)結合的實驗組HPLC圖見圖4。鷹嘴豆提取物中有5個成分可以與0.5、1.0和10.0 U/mL的5-脂氧合酶結合，對5-脂氧合酶存在一定的抑制作用，具有潛在的抗炎活性[17]。各活性成分與酶的結合強度用結合因子為，考察5個化合物與5-脂氧合酶的結合能力。由表2可知，5個活性成分對1.0 U/mL的5-脂氧合酶活性抑制效果顯著，其中化合物5的結合強度最高，其次為化合物2、化合物3、化合物4和化合物1。通過超濾-質譜技術研究鷹嘴豆與5-脂氧合酶的抑制作用，操作簡便，超濾-質譜技術具有高通量檢測的優勢，是一種快速高效的初步篩選復雜提取物中活性成分的手段，具有低成本、操作簡單等優勢。

表2 鷹嘴豆提取物與5-脂氧合酶的結合強度/%

注：a為空白組實驗，b、c、d分別為酶濃度0.5、 1.0、10.0 U/mL的實驗組。圖4 鷹嘴豆提取物與不同濃度5-脂氧合酶結合的HPLC圖

2.5 液-質聯用技術初步鑒定鷹嘴豆中化學成分

利用液-質聯用技術對鷹嘴豆提取物中的化學成分進行初步的分離與鑒定，通過質譜信息與標準品比對，分析鷹嘴豆中的化學成分的信息，結果如表3。利用液-質聯用技術對鷹嘴豆提取物中活性成分進行初步鑒定和解析，根據各化合物的保留時間、分子離子以及碎片離子等信息，鑒定5個具有抑制5-脂氧合酶活性的異黃酮類化合物分別為大豆苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、后莫紫檀素和鷹嘴豆芽素A[19-22]。

表3 LC/MS法初步鑒定鷹嘴豆提取物中的化學成分

3 結論

利用遺傳算法結合響應面優化鷹嘴豆中異黃酮的提取工藝，優化得到最佳提取工藝為：提取時間為1.73 h、乙醇體積分數為78.64%和料液比1∶24.90，在此條件下，鷹嘴豆中異黃酮提取率為0.76 mg/g。利用超濾質譜法篩選出鷹嘴豆中5個具有抑制5-脂氧合酶的活性成分，5-脂氧合酶活度為1.0 U/mL時，抑制酶的活性效果顯著，鷹嘴豆芽素A與5-脂氧合酶結合度最高。