金雀異黃素緩解免疫抑制大鼠運動性疲勞的作用研究

董佳萍， 楊 琪， 謝琳琳， 王鶴霖， 劉殊凡， 遲曉星

(黑龍江八一農墾大學食品學院，大慶 163319)

運動性疲勞是人體腦力和體力持續活動到一定階段時出現的一種生理現象，表現為機體生理過程不能維續其機能在特定水平上和(或)不能維持預定的運動強度[1]。機體的疲勞與免疫能力互相影響。免疫力低下時常伴隨會疲勞感，而長時間的疲勞也同樣容易引起機體的免疫力降低。因此，研究如何降低身體的疲勞感，確保人們能正常工作和健康生活變得至關重要。

金雀異黃素(Genistein)，又稱為染料木素或染料木黃酮，是大豆異黃酮的主要成分，約占大豆中總異黃酮的60%[2]。金雀異黃素是植物雌激素中活性較強的一種，研究表明其具有抗氧化性、抗炎活性、抗腫瘤、保護骨骼肌等功效[3-7]。

目前對于金雀異黃素的抗疲勞與提高免疫力分別有所研究。麻海娟等[8]研究發現，金雀異黃素可顯著上調大鼠脾、胸腺、腎和腦的臟器指數，同時明顯提高血清中的NO和NOS含量。蒙蘭蘭等[9]研究發現，金雀異黃素可升高運動性疲勞大鼠全血中紅細胞、白細胞和淋巴細胞計數,升高血紅蛋白濃度。均說明金雀異黃素具有緩解大鼠運動性疲勞的作用。陳曉蛟[10]研究發現，金雀異黃素可以提高小鼠血清中總IgE、TSLP含量及BALF中IL-4、IL-13細胞因子水平，達到提高免疫力作用。但以上研究都是基于單獨模型的研究，本實驗以金雀異黃素為受試物，建立免疫抑制模型，通過游泳訓練后測定大鼠血清、肝組織及骨骼肌中的疲勞相關指標，探討金雀異黃素對免疫抑制大鼠運動疲勞的影響，為進一步闡明緩解疲勞作用機制。為金雀異黃素的進一步研究利用提供數據支持，為開發緩解疲勞類型的保健品提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

金雀異黃素(純度98%)，環磷酰胺，貞芪扶正顆粒，肝/肌糖原試劑盒、尿氮素(BUN)試劑盒、乳酸(LD)試劑盒、蛋白定量試劑盒。

DK-8D型水浴鍋，TGL-16B臺式離心機，TG-16M低溫冷凍離心機，5424高速離心機，Multiskan Sky全波長酶標儀，T6型紫外可見分光光度計；SH-250電熱恒溫培養箱。

1.2 動物與分組

選取72只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，體重(200±20)g，生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001。大鼠自由飲食，在溫度(20±2) ℃，相對濕度(40～60)%的環境下飼養。大鼠按體重隨機分為6組，每組12只，分別為空白對照組、免疫抑制模型組、金雀異黃素低、中、高劑量組以及陽性對照組。

所有動物實驗均按照黑龍江八一農墾大學動物科學學院動物倫理委員會的批準，按照當地機構要求進行。

每天9:00進行灌胃處理。其中，空白對照組和免疫抑制模型組給予花生油灌胃，低、中、高組灌胃劑量為10、20、40 mg/kg，陽性對照組劑量為貞芪扶正顆粒3.13 g/kg，連續灌胃21 d。此外，大鼠每天14:00進行游泳訓練1次，訓練時用玻璃棒攪動水面，以避免大鼠漂浮偷懶。

1.3 方法

1.3.1 免疫抑制模型建立

適應性喂養一周后，空白對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，其余組大鼠腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg，每日1次，連續3 d[11]。

1.3.2 大鼠游泳訓練實驗

適應性喂養1周后，在直徑為50 cm、水深為50 cm的塑料圓桶中進行大鼠游泳訓練，水溫保持在(24±1)℃。第1天起開始訓練時間為30 min，以后逐日遞增10 min，加至80 min維持此訓練量至實驗結束。剔除不會游泳的大鼠后隨機分組。游泳時用塑料棒驅趕使之不停的游泳，各實驗組大鼠置于水中不互相接觸且每只鼠尾部不與箱底碰觸，用吹風機將游泳后的大鼠皮毛迅速干燥。

1.3.3 力竭游泳時間測定

每組大鼠采用急性力竭負重游泳實驗。于末次給藥后1 h，每組隨機抽取6只大鼠，在大鼠尾部縛大約為體重5%的鉛皮，然后放入水深50 cm、直徑50 cm的塑料圓桶，水溫維持在(24±1)℃。力竭的時間根據從游泳實驗開始直至沉入桶底后10 s不浮出水面進行計算，比較各組大鼠負重游泳至力竭的時間。

1.3.4 指標檢測及方法

大鼠末次灌胃后，各組大鼠禁食12 h，不禁水，稱量體重后將剩余36只大鼠進行游泳訓練，大鼠進行50 min游泳訓練，休息30 min后乙醚麻醉處死，腹主動脈取血3 500 r/min下離心15 min后取上清。大鼠處死后取肝臟、骨骼肌等組織備用。分別按照試劑盒說明書測定指標。

1.3.5 統計學分析

數據采用SPSS 21進行單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較，數據均以均值±標準差(x±s)表示，以組間方差分析P<0.05為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 金雀異黃素對大鼠臟器指數影響

由表1可知，與空白對照組相比，模型組的胸腺指數顯著下降(P<0.01)，提示成功建立免疫抑制模型。與模型組比較，金雀異黃素高劑量組和陽性對照組的大鼠胸腺指數顯著升高(P<0.01)，金雀異黃素各劑量組大鼠的脾臟指數有所提高，但差異不顯著(P>0.05)。金雀異黃素劑量組大鼠脾臟、腎臟和肝臟指數較模型組和空白對照組無顯著差異(P>0.05)。結果表明，金雀異黃素對免疫抑制大鼠胸腺損傷有一定的改善作用。

表1 金雀異黃素對大鼠臟器指數影響

2.2 金雀異黃素對大鼠力竭游泳時間的影響

由表2可知，與模型組相比，金雀異黃素劑量組和陽性對照組可顯著提高力竭游泳時間(P<0.01)。與空白對照組相比，金雀異黃素中、高劑量組和陽性組大鼠平均力竭游泳時間差異極其顯著，其中高劑量組力竭游泳時間延長了50.4%(P<0.01)。結果表明，金雀異黃素可延長免疫抑制大鼠的力竭游泳時間，且力竭游泳時間與金雀異黃素劑量呈正相關。

表2 金雀異黃素對大鼠負重力竭游泳時間的影響

2.3 金雀異黃素對大鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

由表3可知，補充金雀異黃素各劑量組的免疫抑制大鼠運動后肝糖原與肌糖原含量明顯提高。其中，與空白對照組相比，金雀異黃素低劑量組大鼠運動后的肝糖原水平有顯著差異(P<0.05)。與模型組相比，肝糖原含量有所增加但無統計學差異。金雀異黃素中、高劑量組和陽性對照組的肝糖原含量與模型組相比顯著提高，且差異極其顯著(P<0.01)。金雀異黃素各劑量組大鼠肌糖原水平均極其顯著的高于模型組(P<0.01)。結果表明，金雀異黃素在20～40 mg/kg時，可以有效提高免疫抑制大鼠運動后的糖原水平，進而達到提高大鼠的運動耐力。

表3 金雀異黃素對大鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

2.4 金雀異黃素對大鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影響

由表4可知，金雀異黃素對實驗大鼠血清中的尿素氮含量和乳酸含量有明顯的影響，且與金雀異黃素的濃度呈負相關。其中，模型組大鼠血清中尿素氮含量和乳酸含量顯著高于空白對照組(P<0.01，P<0.05)，提示成功建立大鼠免疫抑制模型。與模型組相比，金雀異黃素低劑量組尿素氮含量及乳酸含量無統計學差異。中劑量組尿素氮含量則顯著地低于模型組(P<0.05)，乳酸含量極顯著低于模型組(P<0.01)；高劑量組和陽性對照組極顯著地低于模型組(P<0.01)。結果表明，金雀異黃素可以抑制尿素氮含量的增加，同時減少乳酸的產生。

表4 金雀異黃素對大鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影響

3 討論

現代醫學對疲勞的治療有限，已有學者研究具有抗疲勞作用的潛在替代品，包括傳統中草藥及預防疾病和促進健康的藥用或功能性食品[12]。目前針對緩解疲勞其體內分子機制的認識十分有限，人們逐漸關注功能性食品或傳統藥材潛在替代品，進行研究以期解決這些復雜機體問題并用于改善健康狀況。

胸腺和脾臟是機體的主要免疫器官，其質量的改變可以反映受試藥物對免疫系統的刺激作用[13]。有學者研究指出，黃酮類化合物可以通過免疫系統調節作用提高機體耐受能力，減緩肌肉的損傷、能量的過度損耗，達到抗疲勞作用[14]。本實驗結果表明，模型組大鼠胸腺指數顯著低于正常對照組，表明環磷酰胺抑制了大鼠的胸腺生長發育，造成臟器損傷，而補充金雀異黃素高劑量組和陽性組可不同程度提高大鼠胸腺指數(P<0.05)。結果與麻海娟等[8]在金雀異黃素對運動疲勞大鼠臟器指數及NO/NOS的影響研究中得到的結論相同，運動疲勞大鼠經金雀異黃素干預后，胸腺指數均明顯上調。提示金雀異黃素能減輕環磷酰胺對胸腺的生長抑制作用，可以促進免疫器官分化和成熟進而提高免疫能力，從而達到緩解疲勞的效果。

運動耐力實驗是檢測抗疲勞能力最直接的方式，通過力竭游泳時間的長短可以反映出運動耐力的大小[15-17]。本實驗采用力竭游泳試驗測試大鼠抗疲勞能力，結果表明，給予大鼠不同劑量金雀異黃素可延長大鼠的力竭游泳時間，增強耐力。與王玲玲[18]研究結果具有一致性，分析原因可能是金雀異黃素吸收后，提高大鼠有氧代謝能力，從而增強耐力起到延緩疲勞的效果。

機體活動需要能量，糖原是機體主要的能源儲備，糖原含量的多少直接影響運動能力的強弱[19]。在劇烈運動時，肝糖原直接轉化為糖對機體進行供能，肌糖原則可以通過無氧酵解為肌肉供能，從而延長運動時間，推遲疲勞反應[20]。因此，肝糖原和肌糖原通常作為評價機體抗疲勞的指標[21]。本實驗結果表明，模型組大鼠肝糖原含量較空白對照組顯著降低，說明免疫抑制大鼠較正常運動大鼠肝糖原消耗更迅速。在給予金雀異黃素后，肝糖原和肌糖原含量較模型組顯著增加。夏春榮等[22]和孔凡秀等[23]學者研究結論均表明通過延遲肝糖原和肌糖原的消耗可以達到抗疲勞作用，與本研究結論一致。分析原因為金雀異黃素可能通過減少運動時機體糖原消耗或者提升糖原儲備，持續為機體提供能量，進而延緩疲勞的產生達到抗疲勞效果。

常規情況下，血清中尿素氮含量相對穩定，當機體進行高強度運動時，由于體內糖類和脂肪供能不足，蛋白質和氨基酸會進行分解代謝以提供能量，此時會產生代謝物導致血清中尿素氮水平升高。尿素氮累計越多表示機體疲勞越嚴重[24]。研究表明，乳酸的蓄積是導致運動性疲勞的重要原因，大量乳酸堆積使得肌肉內pH值下降，從而抑制酶活性致使能量供應不足[25]。Zhang等[26]研究發現，玉米須總黃酮可通過降低血乳酸含量發揮抗疲勞功效。陳戰永等[27]研究結果也表明通過減小乳酸與尿素氮生成量進而提高小鼠抗運動疲勞能力。鄧炳楠[28]在大豆異黃酮抗疲勞作用的研究中表明通過降低尿素氮與乳酸含量，達到抗疲勞效果，與本實驗結論具有一致性。表明金雀異黃素可以通過減少尿素氮含量，提高大鼠運動能力并緩解疲勞。同時可以減少乳酸的產生，降低運動后導致的肌肉損傷，從而延緩疲勞的產生，且成劑量依賴性。由于實驗動物之間存在個體差異，分組數量也會導致結論具有一定的局限性。但本實驗得到結論與前人研究結果相似，從而說明金雀異黃素對免疫抑制大鼠有緩解疲勞的效果。

4 結論

金雀異黃素能提高免疫抑制大鼠的胸腺指數，明顯延長實驗大鼠力竭游泳時間，維持肝臟和肌肉中糖原含量，降低大鼠血清中尿素氮含量和乳酸含量。說明，金雀異黃素可以通過提高大鼠臟器指數，從而提高免疫力。通過提高免疫抑制大鼠的運動耐力，促進糖原產生，減少乳酸堆積，達到緩解疲勞的作用效果。金雀異黃素在較高劑量(40 mg/kg)可顯著提高實驗大鼠耐力及調節血清和骨骼肌中疲勞相關生化指標的水平，具有較好的緩解疲勞的功效。