降解玉米赤霉烯酮菌株的篩選、降解機制及特性研究

吳宗芮， 丁 軻，， 余祖華，， 李 旺， 李元曉， 曹平華， 何萬領， 賈艷艷， 劉 寧

(河南科技大學功能微生物與精準營養實驗室1，洛陽 471003) (洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室2，洛陽 471003)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是一種非甾體類真菌毒素，也稱F-2毒素[1]。ZEN主要由禾谷鐮刀菌產生，廣泛存在于谷類作物及其副屬產品中，如玉米、花生及商業性飼料等，從而影響飼料的產量和質量[2]。這些鐮孢屬物種主要生長在溫帶地區的植物上，在溫度為20～25 ℃、濕度大于20%的環境下，ZEN可以在3周內產生[3-5]。ZEN化學結構類似于雌二醇，可競爭性的與雌激素受體競爭性結合，引起早情、流產和死胎等，從而影響動物的生產性能[6]。研究表明，低劑量的ZEN可引起細胞增殖，表現出致癌性，高劑量的ZEN通過凋亡或壞死誘導氧化應激、DNA損傷、線粒體變性以及引起細胞最終死亡[7-10]。因此，ZEN嚴重影響食品安全和畜牧業，給人類和動物的健康和經濟帶來嚴重的危害。

ZEN去除方法主要分為3種：物理法、化學法和生物降解法。物理法降解ZEN是通過熱處理和吸附作用，熱處理雖然會達到高效的降解率，但經熱處理后會破壞食品和飼料的營養物質。吸附劑處理是利用活性炭、鋁硅酸鹽類等吸附降解ZEN，但各種吸附往往具有特異性，降解效果并不理想?；瘜W法主要是采用臭氧、雙氧水或碳酸鈉浸泡等處理降解ZEN，但化學試劑的添加會造成二次污染等弊端。而生物降解法是通過微生物分泌的酶和菌體吸附達到對ZEN的降解，這種方法耗費成本低，安全性高，并且不會破壞食品或飼料的營養物質[11-13]。因此，生物降解法是解決ZEN污染問題的最具前景的措施。已有報道很多微生物對ZEN均有一定的降解效果，但要達到一定降解效率方可有應用價值，所以必須從大量的樣品中進行篩選。Risa等[14]從42株紅球菌屬中發現1株可以降解90%以上的ZEN。Yu等[15]從土壤中分離出1株不動桿菌，用胞外酶在培養基里處理12 h后，未發現ZEN和雌激素樣的代謝物，Tan等[16]從土壤中分離出2株假單胞菌，在含有2 μg/mL ZEN的培養基中培養72 h后，分別能夠降解68%和51%的ZEN。盡管微生物降解ZEN是一種較理想的方法，但所篩選微生物必須是國家允許使用的菌種。本實驗擬以ZEN為唯一碳源，從發霉飼料、土壤及動物糞便中篩選能夠高效降解ZEN的菌株，為利用該菌株降解不同原料中的ZEN提供了生物材料基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

1.1.1 樣品采集

河南省洛陽市某養殖廠發霉飼料、動物糞便、土壤樣品。

1.1.2 主要試劑

ZEN標準品、ZEN常規ELISA檢測試劑盒、細菌基因組提取試劑盒，其他化學試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

酶標儀(Multiskan-FC)、凝膠成像系統(GelDoc XR System) 、PCR 擴增儀(9700T) 。

1.1.4 培養基

初篩培養基：KH2PO41.5 g，Na2HPO42.5 g，(NH4)SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.05 g，pH調至7.0，蒸餾水1 L，高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min，降至室溫后加入終質量濃度為1 μg/mL的ZEN。

LB固體培養基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉10 g，pH調至7.0，蒸餾水1 L，高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min。降至室溫后加入終質量濃度為1 μg/mL的ZEN。

LB液體培養基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母提取物5 g，pH調至7.0，蒸餾水1 L，高壓滅菌鍋121 ℃滅菌30 min。降至室溫后加入終質量濃度為1 μg/mL的ZEN。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

將發霉飼料，動物糞便和土壤分別取約5 g置于200 mL錐形瓶里，加入100 mL的無菌水，于37 ℃、200 r/min振蕩1 h，靜置30 min后，取上清液備用。

1.2.2 ZEN降解菌株的初篩

取200 μL上清液加入含有終質量濃度為1 μg/mL 的ZEN的初篩培養基里，于37 ℃、200 r/min振蕩3 d，取上清液進行10倍梯度稀釋至10-7倍，分別取100 μL涂布于終濃度為1 μg/mL的ZEN的LB固體培養基，置于37 ℃培養24 h。

1.2.3 ZEN降解菌株的純化

挑取LB固體培養基不同形態的菌落劃線于終濃度為1 μg/mL的ZEN的LB固體培養基里，反復劃線純化菌株。

1.2.4 ZEN降解菌株的復篩

將純化過的菌株接于LB液體培養基里，37 ℃、200 r/min振蕩24 h，取200 μL培養液接種于終質量濃度為1 μg/mL的ZEN 5 mL LB液體培養基里，取5 mL LB液體培養基加入終質量濃度為1 μg/mL的ZEN作為空白對照，每個菌株做3個重復，于37 ℃ 200 r/min振蕩24 h。根據玉米赤霉烯酮ELISA試劑盒對檢測培養液中的ZEN含量，按照下列公式計算ZEN的降解率，篩選降解率較高的菌株。

ZEN降解率=(Po-Pn)/Po×100%

式中：Po為對照組ZEN的殘留量；Pn為每個菌株發酵液中ZEN的殘留量。

1.2.5 ZEN降解菌株的鑒定

1.2.5.1 形態學鑒定

將上述降解效果較好的菌株接種于LB固體培養基上，于37 ℃恒溫培養24 h，觀察菌落形態，挑取單菌落進行革蘭氏染色，觀察菌體的顯微形態。

1.2.5.2 16S rDNA的鑒定

利用細菌基因組提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，以DNA為模板，采用桿菌科細菌通用引物，上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’,進行PCR反應，PCR反應體系為：Premix Taq 12.5 μL，模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。擴增后的PCR產物進行測序。將測序結果在NCBI上進行BLAST比對，選取較高的同源性序列，運用MEGA6.0軟件中Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

1.2.6 菌株降解機制的驗證

將菌株接種于LB液體培養基，于37 ℃、200 r/min振蕩24 h，菌液分成2份，1份放4 ℃冰箱，另1份121 ℃滅菌30 min。將2組菌液離心后分離上清和菌體，菌體用無菌PBS洗滌2次后重懸，用超聲細胞破碎儀破碎菌體，獲得細胞內容物。在上述實驗發揮主要降解作用的部分進行處理：加蛋白酶K(65 ℃，水浴2 h)；加蛋白酶K和1% SDS(65 ℃，水浴2 h)；熱處理(100 ℃水浴2 h)。菌體于37 ℃、200 r/min振蕩30 min，其余各處理組振蕩24 h，以終質量濃度為1 μg/mL的ZEN的等量PBS作為對照，每個樣品設置3個重復，用玉米赤霉烯酮ELISA試劑盒檢測各處理組中ZEN殘留量。

1.2.7 不同條件對菌株降解ZEN的影響

分別研究ZEN降解菌株的不同時間(12、24、36、48、72 h)、不同溫度(28、35、37、40、42 ℃)、不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)和不同接種量(1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)對ZEN降解能力的影響，優化其發酵條件。

1.2.8 菌株對不同原料中ZEN的降解

稱取可溶性淀粉、玉米粉和豆粕粉各0.2 g，分別置于50 mL離心管內，加入10 mL蒸餾水，將pH調至優化值，121 ℃滅菌30 min，降至室溫后加入終質量濃度為1 μg/mL的ZEN。將預先培養好的菌液以優化的接種量接入各樣品中，以終質量濃度為1 μg/mL 的ZEN的等量各個飼料樣品作為對照，每個樣品設置3個重復。37 ℃、200 r/min培養優化的時間后取樣，按照ZEN ELISA檢測試劑盒測定各樣品中ZEN的含量。

1.2.9 菌株G-6的安全性實驗

將10只8周齡左右雄性健康的昆明小鼠分為實驗組和對照組2組，每組各5只。將G-6菌株培養過夜后，經活菌測定菌株的活菌數為7.83×108cfu/mL。對照組灌喂無菌生理鹽水，實驗組灌喂G-6菌株，每只小鼠灌胃1.0 mL/d，連續灌胃為3 d，然后對小鼠為期1周的觀察，每天察看并記錄小鼠的精神狀態、采食量、飲水量、糞便及死亡情況等。最后對小鼠進行處死、解剖，觀察小鼠臟器是否出現病理變化。

2 結果與分析

2.1 ZEN降解菌株篩選結果

從樣品中分離出96株菌，將初篩分離的菌以ZEN為唯一碳源的初篩培養基進行培養，初步分離出14株菌，其中6株來自于發霉飼料，分別為M-3、L-12、L-6、M-19、G-6、P-17，4株來自于土壤，分別為G-4、P-12、P-21、M-17，4株來自于動物糞便，分別為P-6、M-11、P-25、M-7。

2.2 ZEN降解率的測定結果

將篩選得到的14株菌接種于含有1 μg/mL ZEN的LB液體培養基中發酵培養，ELISA檢測ZEN毒素含量。由表1可知，來自發霉飼料中分離的G-6菌株降解效果最好，降解率達到81.19%，其余13株分離菌的降解效率均低于51%，因此，選擇G-6菌株進行后續的研究。

表1 分離菌株對ZEN降解率

2.3 G-6菌株的形態特征

由圖1可見，菌株的菌落形態為表面粗糙，邊緣不整齊，不透明，中間隆起。菌株的顯微形態為革蘭氏陽性，桿狀，中等大小，單個存在，少數呈雙鏈狀。具端生芽孢。

圖1 菌株G-6的菌落特征(a)和鏡檢特征(b)

2.4 G-6菌株16S rDAN PCR擴增及測序結果

以菌株G-6的DNA為模板，經PCR擴增后，產物電泳在約1 450 bp處有一條特異性條帶，與預期大小相符，見圖2。經測序獲知該序列為1 424 bp(GenBank登錄號為SUB10218507)。

圖2 菌株G-6的16S rDNA PCR擴增結果

2.5 基于G-6菌株16S rDNA序列系統進化樹結果

將測序結果去NCBI進行BLAST比對，挑選同源性高于99%的菌株，通過MEGA6.0軟件構建系統發育樹，由圖3可知，G-6菌株與解淀粉芽孢桿菌在同一分支上,親緣性最近。因此，鑒定G-6菌株為解淀粉芽孢桿菌。

圖3 菌株G-6基于16S rDNA序列系統進化樹

2.6 G-6菌株降解機制的驗證

菌株的細胞壁對ZEN有吸附作用。活細胞的降解率為56.17%，滅活細胞降解率為38.1%。分析的原因可能是在熱處理的過程中使活細胞的吸附位點失活，從而減少對ZEN的吸附能力。

由圖4可知，菌株無細胞上清的降解率明顯高于細胞內容物，說明菌株降解ZEN的能力主要發生在無細胞上清，菌株降解ZEN的活性物質主要發生在胞外。對菌株無細胞上清進行不同處理，加蛋白酶K處理后，菌株降解ZEN的效率下降至35.17%；加蛋白酶K和1% SDS共同處理后，菌株降解ZEN的效率下降至13.14%；100 ℃水浴2 h后，菌株的降解效率下降至8.31%。

圖4 菌株不同活性成分對ZEN降解能力

圖5 溫度、pH、接種量、時間對菌株降解效率的影響

2.7 G-6菌株降解ZEN的不同條件的影響

由圖5可知，溫度對菌株降解ZEN有一定影響，在28 ℃降解率最低，降解率為53.74%。隨著溫度的升高，在37 ℃降解率最高，降解率為81.19%。當溫度繼續升高至42 ℃時，降解率產生了下降，溫度的升高或降低都會對降解率產生影響?？赡苁窃诓煌瑴囟鹊呐囵B下，菌株的生長受到了一定抑制，使菌株活性下降，降解率也隨之下降。

pH對菌株降解ZEN有顯著影響，pH為3.0時，降解率最低，降解率為25.88%。隨著pH的上升，降解率升高，pH為5.0時降解率最高，降解率為88.47%。當pH大于5時，降解率下降，pH的升高或降低都會對降解率產生影響。因此在pH為5.0時菌株能發揮最大的降解率。

接種量對菌株降解ZEN的能力有一定影響，接種量為1%～3%時，隨著接種量的增加，降解率也增加，接種量為3%時降解率最高，降解率為81.98%。當接種量繼續增加時，降解率出現了下降，接種量的升高或降低都會對降解率產生影響?？赡苁怯捎诮臃N量太小，不能達到菌株活性的高度，但太多的接種量會消耗培養基里的營養物質，使菌株活性下降。

隨著發酵時間的延長，菌株的降解率也隨之增加?？赡茉谇捌赯EN抑制了菌株生長，使菌株活性低，但隨著發酵時間的延長，菌株的活性逐漸上升，72 h在LB培養基中達到100%降解。

2.8 G-6菌株對不同原料中ZEN的降解

將溫度、pH、接種量、時間調至優化值，在發酵72 h的不同飼料中ZEN含量的采用ELISA檢測試劑盒測定，在72 h后，菌株能在可溶性淀粉、玉米粉、豆粕粉中達到100%降解。

2.9 G-6菌株的安全性實驗結果

實驗結果發現，2組小鼠的精神狀態、采食量、飲水量、糞便均無異常，且沒有出現死亡和發病現象。此外，將小鼠處死后觀察發現小鼠臟器未出現任何異常變化，說明該菌株無毒性和致病性。

3 討論

ZEN是最常見的真菌毒素之一，嚴重危害人類食品安全和動物飼料安全，篩選切實可行的辦法降解ZEN對保障我國食品和飼料安全具有重要意義。一般在篩選降解菌株需注意：從樣品上應選擇發霉飼料、動物糞便和土壤去篩選，很多高效降解的菌株是在極端的生長條件發現的[17]，由于菌株在極端條件下長期生存，經過大自然馴化，菌株產生了高耐受性，從而形成了有降解活性的微生物；從篩選方法上從培養基內加入ZEN或是結構相似的環戊酮為唯一碳源進行篩選，金博文等[18]以環戊酮為唯一碳源從糞便中篩選到了1株高效降解ZEN的多食鞘氨醇桿菌，為樣品和方法上進行定性篩選提供了途徑。本研究以ZEN為唯一碳源，從發霉飼料中篩選到了1株高效降解ZEN的解淀粉芽孢桿菌，37 ℃24 h內從培養基降解了81.19%的ZEN。

解淀粉芽孢桿菌為益生菌，關于益生菌降解ZEN已有報道。Ragoubi等[19]發現保加利亞乳酸菌在37 ℃24 h內從MRS培養基去除57%的ZEA；Keller等[20]發現釀酒酵母可在30 ℃2 d內清除培養基里90%的ZEN；耿海榮等[21]篩選出1株枯草芽孢桿菌在50 ℃36 h可降解93%的ZEN。本實驗篩選到的解淀粉芽孢桿菌經條件優化后降解率均高于這些益生菌，由于菌種之間的差異性以及菌株之間不同的培養條件會影響菌株的生長活性，從而在降解率上表現出了不同差異，當菌株在生長環境適宜，營養條件充分的情況下，菌株生長活性高，才能充分降解ZEN。本研究對菌株在不同飼料原料中的降解進行了驗證，調至各優化值在可溶性淀粉、玉米粉、豆粕粉降解了100%的ZEN，均高于Fu等[22]和潘麗婷等[23]篩選到的芽孢桿菌在玉米粉中去除ZEN的降解率，解淀粉芽孢桿菌可作為飼料添加劑去使用，以改善消化，增加營養吸收，優化動物的飼料效率，為維護動物機體健康提供了安全保障。

對上清液、細胞內容物、菌體細胞進行降解ZEN的研究，菌株上清液降解率均高于細胞內容物和菌體細胞，初步認為主要降解ZEN的活性物質是胞外酶。提取菌株胞外酶降解霉菌毒素已有報道，Qin等[24]從枯草芽孢桿菌克隆了染料脫色過氧化物酶，并在大腸桿菌中成功表達，重組的酶基因可降解多種霉菌毒素，王壬豐等[25]將粉紅黏帚霉中的ZEN降解酶ZHD101成功在馬克斯克魯維酵母表達，并且能降解發霉玉米樣本中的ZEN。雖然有些微生物能對霉菌毒素產生降解，但由于產生的降解毒性或菌株本身并不是國家認定的安全菌株，并不能直接投入到生產中去，然而它們提供的酶基因為預防霉菌毒素提供了另一種選擇。

4 結論

本研究以ZEN為唯一碳源進行分離篩選，從發霉飼料里篩選出1株高效降解ZEN的菌株G-6，其降解率為81.19%。通過形態學和16S rDAN的鑒定，鑒定G-6為解淀粉芽孢桿菌。菌株主要通過胞外酶發揮降解作用，同時菌株細胞壁也有吸附作用。G-6菌株最佳降解ZEN的條件為：溫度37 ℃，pH5.0，接種量3%，培養時間72 h。G-6菌株在終質量濃度為1 μg/mLZEN的可溶性淀粉、玉米粉、豆粕粉中達到100%降解，菌株的安全性實驗證明本菌株無毒。