低溫等離子體對粳稻表面霉菌的抑制作用及其品質(zhì)的影響

謝 輝, 王建峰, 曹 涌, 劉興泉, 李 玲, 郭 儉

(浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院; 現(xiàn)代糧食產(chǎn)業(yè)學(xué)院，杭州 311300)

稻谷是我國第一大糧食作物，其總產(chǎn)量與播種面積位居世界第一[1]。稻谷作為主要的糧食食用品種，供應(yīng)著一半以上人口的口糧[2]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)2019年對全球農(nóng)產(chǎn)品各環(huán)節(jié)糧食損失指數(shù)估計，全球約14%的糧食在從生產(chǎn)至零售環(huán)節(jié)之前被損失掉，約3.8億t[3]。據(jù)2020年國家糧食和物資儲備局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，我國每年有約700億斤的糧食在儲藏、運輸和加工等環(huán)節(jié)不斷損失[3]。這對我國儲糧工作提出了更高的要求。

為提高稻谷耐儲性及品質(zhì)，常用于稻谷儲藏的技術(shù)有低溫儲藏技術(shù)、氣調(diào)儲藏技術(shù)和藥劑熏蒸技術(shù)等。然而，低溫儲藏技術(shù)和氣調(diào)儲藏技術(shù)對倉房的氣密性和隔熱性要求嚴(yán)格，倉房的改造費用昂貴，稻谷儲藏成本較高[4]。而使用藥劑熏蒸會不斷提高儲糧害蟲的耐藥性，必須不斷提高熏蒸藥劑的濃度才能實現(xiàn)有效熏蒸[5]。

等離子體，又稱為電漿，被認(rèn)為是物質(zhì)除固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)的第四態(tài)，是原子或分子被電離后產(chǎn)生的離子化氣體狀態(tài)物質(zhì)，可以分為高溫等離子體和低溫等離子體[6]。當(dāng)電子溫度遠(yuǎn)高于離子溫度，體系處于非熱平衡狀態(tài)時，體系中的氣體為輕度電離，放電溫度接近室溫，故被稱為低溫等離子體。低溫等離子體是一種新型食品冷殺菌技術(shù)，通過電離空氣產(chǎn)生活性物質(zhì)作用于食品表面的微生物達(dá)到殺菌的目的[7],具有高效、快捷、安全無污染等優(yōu)點。目前，該技術(shù)已在如肉類、果蔬和水產(chǎn)品等食品中有相關(guān)的應(yīng)用研究[8-10]。徐慧倩等[11]證實低溫等離子體能有效減緩南美白對蝦的腐敗變質(zhì)，并且隨著冷藏時間的變化，經(jīng)過低溫等離子體處理的南美白對蝦的質(zhì)構(gòu)特性、色澤的保持效果都顯著優(yōu)于對照組。喬維維等[12]研究發(fā)現(xiàn)低溫等離子體能夠有效殺滅牛肉表面的微生物，降低牛肉的細(xì)菌殘留量，并且較好保持牛肉的色澤。因此，低溫等離子體在農(nóng)產(chǎn)品保鮮和儲藏上的應(yīng)用也越來越廣泛[13]，但目前該技術(shù)應(yīng)用于糧食儲藏方向的相關(guān)報道較少。

前期課題組通過對倉儲稻谷霉菌群落進(jìn)行分析，選擇亮白曲霉、黑曲霉、米根霉、草酸青霉4種稻谷儲藏優(yōu)勢霉菌作為研究對象，研究低溫等離子體對粳稻表面4種霉菌的抑菌效果與粳稻的品質(zhì)變化之間的關(guān)系，為低溫等離子體技術(shù)應(yīng)用于糧食安全儲藏領(lǐng)域提供參考。

1 材料與方法

1.1 稻谷樣品

稻谷采自浙江省中央儲備糧庫中的粳稻谷，采用 3 層、5 點取樣法，分別在糧倉東南角、東北角、西南角、西北角以及中央點作為取樣點，每個取樣點分別在距糧堆表層 0.5 m、中央層、距地面 0.5 m 取樣。每倉 15 個取樣點，樣品放置在無菌采樣袋中，于4 ℃保存。

圖1 介質(zhì)阻擋放電等離子體裝置示意圖

1.2 主要儀器與設(shè)備

介質(zhì)阻擋放電等離子體裝置，其示意圖如圖1，工作電壓：20 kV。定制交流高壓電源：GR-A-P30-150Ma型，MJ-系列恒溫培養(yǎng)箱，T6新世紀(jì)可見分光光度計，JLG-Ⅱ礱谷機，LC-20A液相色譜儀，GCMS-QP201PLUS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.3 指標(biāo)及測定方法

低溫等離子體裝置操作：將需要處理的樣品放到培養(yǎng)皿中，再將其放到如圖1所示的DBD處理室中，打開電源，將電壓調(diào)到20 kV，處理相應(yīng)的時間。

真菌的活化：草酸青霉(PenicilliumoxalicumACCC 32574)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，28 ℃培養(yǎng)5 d，5 ℃儲藏。米根霉(RhizopusoryzaeCICC 3010)和黑曲霉(AspergillusnigerCICC 2041)用PDA培養(yǎng)基, 28 ℃培養(yǎng)5 d，5 ℃儲藏。亮白曲霉(AspergilluscandidusACCC 30347)用014馬鈴薯葡萄糖瓊脂，28 ℃培養(yǎng)5 d，5 ℃儲藏。真菌的活化可參考《菌種活化操作方法》[14]。

稻谷常見真菌活性的測定：將用1%次氯酸鈉溶液處理過的無菌干燥稻谷分為9組。取5 g無菌稻谷浸泡到等量含有真菌的生理鹽水中，使其充分接觸。再將9組稻谷分別進(jìn)行0～8 min低溫等離子體處理，然后放入裝有45 mL生理鹽水的藍(lán)口瓶中超聲洗去稻谷表面的真菌。選取合適梯度的稀釋液100 μL到凝固好的平板培養(yǎng)基，按涂布法涂勻后用封口膜密封于28 ℃的MJ-系列霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。記錄菌落數(shù)量，計算抑菌率。

稻谷中蛋白質(zhì)組分的測定：稱取分別經(jīng)過0～8 min處理的米粉各0.1 g，共9組，參考楊靜等[15]的連續(xù)提取法，依次用蒸餾水、2%氯化鈉、75%乙醇和0.04 mol/L氫氧化鈉4種溶劑對清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白進(jìn)行分離提取，然后采用考馬斯亮藍(lán)法依次對各組分蛋白含量進(jìn)行測定。

稻谷中淀粉含量的測定：稱取經(jīng)過等離子體處理0～8 min的米粉各2 g，共5組，參照 GB 5009.9—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測定》中的酸水解法進(jìn)行測定。

稻谷脂肪酸組分的測定：分別取經(jīng)過0～8 min處理過的米粉各2.5 g，共5組，放置于50 mL離心管中。加入25 mL石油醚，在42 ℃，300 W的條件下超聲37 min后以4 000 r/min離心10 min。取上清液至圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上50 ℃旋蒸至無石油醚，烘干至恒重。加入0.5 mL 5 mg/mL十一烷酸甘油三酯標(biāo)液(125 mg十一烷酸甘油三酯加25 mL甲醇)和25 mg焦性沒食子酸。加入2 mL正己烷于圓底燒瓶中并轉(zhuǎn)移到10 mL的具塞試管中，加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，充分振蕩后于70 ℃水浴15 min，隨后加入4 mL 0.5 mol/L的H2SO4-CH3OH在70 ℃水浴鍋中水浴5 min，冷卻至室溫，加入2 mL正己烷和2 mL蒸餾水，加0.2 g NaCl，充分振蕩后靜置，取上層液體過膜，上機分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel處理數(shù)據(jù)計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS24和Origin2019b軟件進(jìn)行單因素分析和作圖。

圖2 不同處理時間下低溫等離子體對對粳稻中4種霉菌的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷真菌抑菌率

由圖2可知，隨著低溫等離子體處理時間的增長，根霉、黑曲霉、草酸青霉和亮白曲霉的抑菌率總體上呈上升趨勢。根霉在處理時間到達(dá)3 min后，其抑菌率與對照組相比顯著提高(P<0.05)；在處理時間到達(dá)8 min時，抑菌率可達(dá)到72%。這說明低溫等離子體對米根霉的抑菌效果顯著(P<0.05)。黑曲霉在處理時間到達(dá)3 min后，其抑菌率與對照組相比顯著提高(P<0.05)；在6 min之后，抑菌率基本保持不變趨向于平緩；在處理時間到達(dá)8 min時，黑曲霉的抑菌率可達(dá)到79%。這說明低溫等離子體對黑曲霉的抑菌效果顯著(P<0.05)。草酸青霉在處理時間到達(dá)2 min后，抑菌率與對照組相比顯著提高(P<0.05)；在處理時間到達(dá)8 min時，其抑菌率可達(dá)到64%。這說明低溫等離子體對草酸青霉的抑菌效果顯著(P<0.05)。亮白曲霉在處理時間到達(dá)2 min后，抑菌率與對照組相比顯著提高(P<0.05)；在處理時間到達(dá)8 min時，對亮白曲霉的抑菌率可達(dá)到66%。這說明低溫等離子體對亮白曲霉的抑菌效果顯著(P<0.05)。

隨著低溫等離子體處理時間的增長，低溫等離子體對4種霉菌的抑菌率均有顯著提高(P<0.05)。Niemira等[16]利用等離子體處理蘋果時，也發(fā)現(xiàn)處理組的殺菌率隨處理時間的增加而增加。Misra等[17]利用等離子體抑制櫻桃表面的細(xì)菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長，抑菌率逐漸提高。

2.2 粳稻蛋白質(zhì)組分

稻谷中蛋白質(zhì)含量與品種有關(guān)，含量高有利于大米的吸水膨脹和糊化，增加大米黏性，改善口感[18]。由圖3可知，清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的含量一開始都先隨處理時間而提高。清蛋白含量在2 min后便趨于平衡，不會隨處理時間發(fā)生顯著變化。而球蛋白含量在處理5 min后又隨處理時間而增多。醇溶蛋白含量在2 min時達(dá)到最大值1 642.2 μg/g后又趨于平穩(wěn)，直到7 min。這可能是因為低溫等離子體中的高能電子和活性氧等物質(zhì)破壞了稻谷細(xì)胞壁組成成分里的共價鍵實現(xiàn)對稻谷表面的蝕刻，使稻谷表面出現(xiàn)凹陷和裂痕[19,20]，從而導(dǎo)致稻谷內(nèi)部的清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白更容易被提取出來。

圖3 不同處理時間下低溫等離子體 對粳稻蛋白質(zhì)組分含量的影響

谷蛋白含量隨處理時間先減少，到1 min后谷蛋白含量隨處理時間趨于平緩，無顯著變化。有研究表明，水稻種子的谷蛋白主要由分子質(zhì)量為36 000和22 000兩種亞基通過雙硫鍵結(jié)合形成的[21],而低溫等離子體對雙硫鍵可能會有破壞作用[22]。雖然，谷蛋白含量也可能因為低溫等離子體對稻谷表面的蝕刻作用而提高，但是低溫等離子體降解谷蛋白的數(shù)量大于谷蛋白由于蝕刻作用而多提取出來的數(shù)量，總體上谷蛋白含量是下降的。醇溶蛋白含量在 7 min后降低(P<0.05)，也可能是這一原因所造成的。另外，等離子體對二硫鍵的破壞作用，可以在一定程度上提高米飯的黏度，提升米飯的食用品質(zhì)[23]。

2.3 粳稻淀粉含量

淀粉是稻谷中的主要成分，是影響稻谷食用品質(zhì)的重要因素之一。圖4為不同處理時間下粳稻的淀粉含量變化，與對照組相比，處理時間為4 min的淀粉含量無顯著變化，而處理時間為6、8 min時，與對照組相比，粳稻的淀粉含量有所下降(P<0.05)，這可能是因為處理時間過長導(dǎo)致部分淀粉被氧化分解。這說明適當(dāng)?shù)牡蜏氐入x子體處理對粳稻的淀粉含量無顯著影響，但是處理時間過長會導(dǎo)致粳稻淀粉下降(P<0.05)。并且結(jié)合抑菌率實驗，可以發(fā)現(xiàn)跟對照組相比，在處理時間為4 min時，4種真菌的抑菌率均已顯著提高(P<0.05)。所以只要控制合適的處理時間，就可以在不影響稻谷的淀粉含量的前提下，有效抑制稻谷霉菌生長。雖然高強度的等離子體處理會使淀粉含量降低，但同時也能改性淀粉的某些功能。比如Zou等[24]發(fā)現(xiàn)，等離子體可以使淀粉的羥基極化，在不破壞淀粉主體結(jié)構(gòu)的情況下促進(jìn)淀粉的交聯(lián)。Thirumdas等[25]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)等離子體處理后，大米的蒸煮時間有效縮短，并且其吸水率提高。

表1 不同處理時間下低溫等離子體對粳稻的脂肪酸組分的影響/%

圖4 不同處理時間下低溫等離子體 對粳稻淀粉含量的影響

2.4 稻谷脂肪酸組分

稻谷自身的呼吸作用和一些環(huán)境因素的影響會使稻谷籽粒中的脂類物質(zhì)水解而產(chǎn)生游離脂肪酸，這些游離脂肪酸不穩(wěn)定很容易發(fā)生酸敗現(xiàn)象從而影響稻谷品質(zhì)，因此根據(jù)脂肪酸組分的變化可以衡量稻谷品質(zhì)是否受到影響。并且不飽和脂肪酸對人體健康具有重要作用，如α-亞麻酸和二十碳五烯酸具有促進(jìn)大腦發(fā)育、保護(hù)視力、降血脂和預(yù)防心血管疾病等多種生理作用[26]。對處理0、2、4、6、8 min時間里的稻谷進(jìn)行脂肪酸組成成分的鑒定，經(jīng)過譜庫檢索匹配，整理出了相似度較大的11種脂肪酸，如表1所示。經(jīng)過低溫等離子體處理4 min后，只有十五烷酸的含量與對照組相比略有提高(P<0.05)。但是隨著處理時間的繼續(xù)延長， 十五烷酸含量無顯著變化。而低溫等離子體處理對其余10種脂肪酸均無顯著影響。盡管低溫等離子體中存在羥自由基、超氧陰離子自由基和過氧化氫等物質(zhì)，會對不飽和脂肪酸產(chǎn)生氧化作用[27]，但是由表1可知，粳稻的亞麻酸、反-9-十八碳烯酸和反-11-二十碳烯酸這些不飽和脂肪酸的含量并未減少，甚至反-11-二十碳烯酸含量還會升高。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是等離子體在一定程度上促進(jìn)脂肪的水解，但無法對粳稻內(nèi)部的不飽和脂肪酸產(chǎn)生氧化作用。

3 結(jié)論

采用低溫等離子體技術(shù)對根霉、黑曲霉、草酸青霉和亮白曲霉4種稻谷儲藏中常見霉菌進(jìn)行處理，4種霉菌的抑菌率隨處理時間而顯著上升(P<0.05)。粳稻經(jīng)過低溫等離子體處理后，除了十五烷酸，其他脂肪酸含量與對照組相比無顯著變化；淀粉含量則有所下降(P<0.05)；實驗組的蛋白質(zhì)組分中的球蛋白、醇蛋白和清蛋白相比對照組均略有上升，只有谷蛋白的實驗組比對照組顯著下降。適量時間的低溫等離子體處理既能有效地抑制根霉、黑曲霉、草酸青霉和亮白曲霉等4種常見真菌的生長，并且能夠較好地保證稻谷的品質(zhì)，而長時間的處理則會破壞稻谷的食用品質(zhì)。本實驗只是初步探究了低溫等離子體技術(shù)應(yīng)用于稻谷霉菌控制領(lǐng)域的可行性。未來對于低溫等離子體的抑菌機理還需更加深入的研究，如該技術(shù)對稻谷風(fēng)味以及感官評價的影響，不同處理電壓、不同氧氣比例對真菌毒素的降解效果等仍需進(jìn)一步的研究。