呼吸道病原菌在細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性組和陰性組中多重定量PCR檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比分析

卓獻(xiàn)霞 趙建康 曹 彬*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2. 中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100029)

下呼吸道感染主要是指發(fā)生于氣管、支氣管和肺部的感染[1-2]。引起下呼吸道感染的病因較多，其中細(xì)菌感染約占全部病因的10% ～ 60%[3-5]。痰和支氣管肺泡灌洗液是用于檢測(cè)下呼吸道感染的最常用標(biāo)本，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)細(xì)菌病原體不僅靈敏度較低、耗時(shí)較長(zhǎng)，且無(wú)法對(duì)病原體進(jìn)行準(zhǔn)確定量。而分子診斷方法不僅快速、靈敏[6-7]，并且能對(duì)部分病原體進(jìn)行準(zhǔn)確定量[8-10]。本研究采用的多重定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)是一種新開(kāi)發(fā)的針對(duì)常見(jiàn)下呼吸道細(xì)菌感染診斷的方法，目的是評(píng)估該方法在下呼吸道標(biāo)本細(xì)菌定量方面的性能。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019年11月至2021年3月在中日友好醫(yī)院臨床微生物與感染實(shí)驗(yàn)室125例下呼吸道感染患者的痰液或支氣管肺泡灌洗液，同時(shí)采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和多重定量PCR方法檢測(cè)病原體，將其中多重定量PCR陽(yáng)性的101例患者作為研究對(duì)象。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①多重定量PCR陰性；②年齡<18歲；③活動(dòng)性肺結(jié)核患者；④囊性纖維化患者；⑤痰質(zhì)量不合格(痰涂片革蘭染色鏡檢提示白細(xì)胞<25個(gè)/低倍視野及扁平上皮細(xì)胞>10個(gè)/低倍視野)。本研究已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2019-170-K116-2)，所有研究對(duì)象或其家屬均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 資料收集

收集入組患者的基本信息(姓名、性別、年齡、有無(wú)發(fā)熱、咳嗽、咳痰、胸痛、呼吸困難、咯血、肺部影像學(xué)異常、機(jī)械通氣、住院死亡)同時(shí)記錄患者的診斷類(lèi)型。

1.3 樣本處理和分組

對(duì)從125例患者中收集的痰或支氣管肺泡灌洗液樣本進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)和多重定量PCR(北京卓誠(chéng)惠生生物公司提供)檢測(cè)，把多重定量PCR陽(yáng)性病例分為培養(yǎng)陽(yáng)性組和培養(yǎng)陰性組，同時(shí)比較各種細(xì)菌在培養(yǎng)陽(yáng)性組和培養(yǎng)陰性組細(xì)菌定量的差異。應(yīng)用多重定量PCR檢測(cè)如下目標(biāo)病原菌：鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、糞腸球菌(Enterococcusfaecium)、屎腸球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基本信息比較

所有樣本在采樣前均已暴露于抗菌藥物，在多重定量PCR陽(yáng)性病例中，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性31例，細(xì)菌培養(yǎng)陰性70例，其中社區(qū)獲得性肺炎44例、醫(yī)院獲得性肺炎18例、慢性阻塞性肺疾病急性加重21例和支氣管擴(kuò)張合并感染18例。與細(xì)菌培養(yǎng)陰性組比較，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性組的住院病死率更高(P<0.05)。在醫(yī)院獲得性肺炎患者中細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性比細(xì)菌培養(yǎng)陰性更常見(jiàn)，且兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 101例多重定量PCR陽(yáng)性患者的基本信息

2.2 多重定量PCR方法在細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性組和陰性組檢出病原體次數(shù)比較

在101例多重定量PCR陽(yáng)性樣本中，多重定量PCR在培養(yǎng)陽(yáng)性組共檢出目標(biāo)病原菌陽(yáng)性33次，在培養(yǎng)陰性組共檢出目標(biāo)病原菌陽(yáng)性144次。在培養(yǎng)陽(yáng)性組和陰性組均以銅綠假單胞菌檢出率最高，但培養(yǎng)陽(yáng)性組的檢出率高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；另外陰性組的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌的檢出率均高于陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 多重定量PCR方法在細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性組和培養(yǎng)陰性組檢出病原體次數(shù)比較

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性組和陰性組細(xì)菌定量中位數(shù)比較

在多重定量PCR陽(yáng)性標(biāo)本中，比較細(xì)菌在培養(yǎng)陽(yáng)性組和培養(yǎng)陰性組中的定量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在培養(yǎng)陽(yáng)性組的細(xì)菌定量中位值大于細(xì)菌培養(yǎng)陰性組(1.44×108copies/mLvs1.22×107copies/mL)。鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌也得到類(lèi)似的結(jié)果，在培養(yǎng)陽(yáng)性組和陰性組的定量中位值分別是7.10×108copies/mLvs4.83×106copies/mL(鮑曼不動(dòng)桿菌)和4.28×107copies/mLvs5.77×104copies/mL(肺炎克雷伯菌)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，詳見(jiàn)圖1。其余9種目標(biāo)病原菌因無(wú)培養(yǎng)陽(yáng)性或培養(yǎng)陽(yáng)性病例太少而無(wú)法進(jìn)行培養(yǎng)陽(yáng)性組和陰性組細(xì)菌定量的比較。

圖1 比較細(xì)菌病原體在培養(yǎng)陽(yáng)性組和陰性組的中位細(xì)菌定量值

3 討論

與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法比較，分子診斷技術(shù)具有快速、靈敏、特異等優(yōu)勢(shì)[11]，且部分分子診斷方法能對(duì)病原體進(jìn)行準(zhǔn)確定量。本研究在101例多重定量PCR陽(yáng)性樣本中，使用多重定量PCR分子診斷方法在細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性組檢出目標(biāo)病原體33次，在細(xì)菌培養(yǎng)陰性組檢出目標(biāo)病原體144次，且多重定量PCR檢測(cè)細(xì)菌病原體定量中位值在細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性組明顯高于細(xì)菌培養(yǎng)陰性組。此外，多重定量PCR方法獲取病原學(xué)結(jié)果僅需要3～6 h，耗時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。

本研究中，多重定量PCR在培養(yǎng)陽(yáng)性組的銅綠假單胞菌檢出率高于在培養(yǎng)陰性組的檢出率，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和分子診斷法檢測(cè)銅綠假單胞菌敏感性較好有關(guān)[12-13]，且銅綠假單胞菌多發(fā)生于醫(yī)院內(nèi)感染，對(duì)一般的廣譜抗菌藥物不敏感，如醫(yī)院獲得性肺炎。雖然本研究中所有樣本均暴露于抗菌藥物，但它對(duì)培養(yǎng)法檢出銅綠假單胞菌影響不大，這可能是培養(yǎng)陽(yáng)性組檢出率高于陰性組的原因之一。此外，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌和糞腸球菌在培養(yǎng)陰性組的病原體檢出率高于陽(yáng)性組，有研究[14]顯示， 肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等細(xì)菌對(duì)抗菌藥物較敏感，而本研究納入所有樣本均已暴露于抗菌藥物，因而這些對(duì)抗菌藥物較敏感的細(xì)菌在暴露于抗菌藥物后已死亡，導(dǎo)致培養(yǎng)陰性，而多重定量PCR檢測(cè)的是樣本的核酸，不管是否已暴露于抗菌藥物，其敏感性不受影響，這可能是培養(yǎng)陰性組病原體檢出率高于陽(yáng)性組的原因之一。

在對(duì)細(xì)菌定性檢測(cè)的同時(shí)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注細(xì)菌的定量。一項(xiàng)研究[15]納入了84例診斷為肺炎的患者并采集了84份支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本，同時(shí)采用傳統(tǒng)培養(yǎng)和Unyvero肺炎系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Unyvero分子診斷方法在細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性組的信號(hào)強(qiáng)度高于培養(yǎng)陰性組，這一結(jié)果與本研究的細(xì)菌定量中位值在培養(yǎng)陽(yáng)性組高于培養(yǎng)陰性組的結(jié)果是一致的。

本研究也存在一些局限性。首先，本研究是單中心前瞻性研究，僅納入了101例樣本進(jìn)行分析，樣本量相對(duì)較少，研究結(jié)果可能代表性不強(qiáng)，今后還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量及多中心收集臨床樣本進(jìn)一步分析。其次，本研究收集的樣本均已暴露于抗菌藥物，一些對(duì)抗菌藥物較敏感的細(xì)菌在培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這可能是培養(yǎng)陽(yáng)性率較低的原因之一。因此，在以后類(lèi)似的研究中可以考慮收集未暴露于抗菌藥物的呼吸道樣本進(jìn)行對(duì)照分析。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明卓獻(xiàn)霞、趙建康：提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，采集、分析數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文；曹彬：總體把關(guān)，審定論文。