日照綠茶粗多糖脫蛋白研究

王傳名，董 祺，管從勝，*

(1.山東大學化學與化工學院，山東濟南250061;2.濟南老來壽生物技術有限公司，山東濟南250101)

日照綠茶粗多糖脫蛋白研究

王傳名1，董 祺2，管從勝1，*

(1.山東大學化學與化工學院，山東濟南250061;2.濟南老來壽生物技術有限公司，山東濟南250101)

以日照綠茶粗多糖為原料，采用蛋白質脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量為評價指標，研究了Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸法對茶多糖粗提物脫蛋白的影響。實驗結果表明:Sevag法茶多糖含量較高、茶多糖保留率較低且操作較復雜，鞣酸法茶多糖保留率較高、蛋白質脫除率較低，三氯乙酸法的脫蛋白效果最好。用三氯乙酸脫蛋白時，茶多糖溶液pH為4.0，蛋白脫除率為68.4%，茶多糖保留率為66.8%，茶多糖含量為72.5%。

日照綠茶，茶多糖，脫蛋白

Abstract:Rizhao green tea crude polysaccharides was used as material in this study.The effects of three deproteinization methodswere studied bythe deproteinization rate，polysaccharidesretention rate and polysaccharides content.The results showed that Sevag method had higher polysaccharides content，lower polysaccharidesretention rate and the operation was complicated.Digallic acid method had higher polysaccharides retention rate and lower deproteinization rate.The most effective method was trichloroacetic acid method.As the pH value of polysaccharides solution was 4.0 adjusted by trichloroacetic acid，the results were:the deproteinization rate 68.4%，the polysaccharides retention rate 66.8%and the polysaccharides content 72.5%.

Key words:Rizhao green tea;tea polysaccharides;deproteinization

茶作為中國最流行的飲料，其保健功能也越來越受到大家的重視。我國民間一直流傳著泡飲粗老茶可以治療糖尿病的說法。茶多糖是茶葉中的一種重要的生物活性組分，其降血糖功能早已被公認。現代醫學研究也表明，茶多糖具有降血糖、降血脂、抗凝血、抗血栓、降血壓、防輻射、增強機體免疫力及增加冠狀動脈血流量等多種功效［1－4］。茶多糖是由葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、巖藻糖等單糖組成的雜聚糖［5－7］，在提取茶多糖的過程中，常會有大量的蛋白質被一同提取出來，影響了茶多糖的純度。去除茶多糖粗提物中的蛋白一直是茶多糖純化過程中的一大難題。國內外對茶多糖粗提物脫蛋白的方法研究主要有Sevag法、三氯乙酸法、鹽酸法、鞣酸法和酶法等［8－10］。目前，國內市場上可銷售的茶多糖純度較低，含量僅為20%左右。若能從中低檔茶葉及粗老枝葉中提取純化出較高純度的茶多糖，并制成保健品，將會對茶葉的綜合利用和保健品市場有重要的意義。本文以日照綠茶粗多糖為原料，采用蛋白脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量為評價指標，研究了Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸法對粗多糖脫蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗多糖 實驗室中以日照綠茶為原料，在提取分離茶多酚時富集水相中的茶多糖得到茶多糖粗提物;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G－250 美國Sigma公司;三氯乙酸、鞣酸、氯仿、正丁醇、蒽酮、濃硫酸、葡萄糖 均為國產分析純。

JP－A型電子天平 太倉市東亞天平儀器有限公司;HHS1－4型電子恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠;SS－300型三足式離心機 江蘇張家港市南洋機械有限公司;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HY－4調速多用振蕩器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;PHS－2C型數顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多糖脫蛋白方法 以日照綠茶為實驗原料，采取水溶劑提取和乙酸乙酯萃取的方法分離茶多酚，同時以乙醇沉淀的方法富集水相中的茶多糖，得到粗多糖。

每次脫蛋白實驗稱取粗多糖3.0g，溶解在600mL去離子水中，得到濃度為5.0mg/mL的水溶液。

1.2.1.1 Sevag法脫蛋白 取100mL茶多糖水溶液6份，分別用 Sevag 試劑(氯仿∶正丁醇 =4∶1)處理 1、2、3、4、5和6次。每次加1/3體積的Sevag試劑，攪拌30min，靜置分離出下部有機層后，收集上層茶多糖水溶液，取樣測其糖含量和蛋白質含量后，加3倍體積95%的乙醇沉淀，離心分離得到純化茶多糖，經過冷凍干燥后稱重，計算茶多糖含量。

1.2.1.2 三氯乙酸法脫蛋白 取100mL茶多糖水溶液6份，分別用5%的三氯乙酸調節pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 和5.5，攪拌并靜置 2h 后，離心 15min，除去底部沉淀，收集上層茶多糖水溶液，取樣測其糖含量和蛋白質含量后，加3倍體積95%的乙醇沉淀。離心分離得到純化茶多糖，冷凍干燥后稱重，計算茶多糖含量。

1.2.1.3 鞣酸法脫蛋白 取100mL茶多糖粗提物水溶液6份，分別用5%的鞣酸調節pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5，攪拌并靜置2h后，離心15min，除去底部沉淀，得到上層茶多糖水溶液，取樣測其糖含量和蛋白質含量后，加3倍體積95%的乙醇沉淀。離心分離得到純化茶多糖，冷凍干燥后稱重，計算茶多糖含量。

1.2.2 茶多糖保留率、茶多糖含量和蛋白質含量的測定

1.2.2.1 茶多糖保留率、茶多糖含量測定 采用蒽酮－硫酸法，以葡萄糖為標準樣品、吸光度為縱坐標和葡萄糖濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線

根據吸光度與葡萄糖濃度的關系，得到線性回歸方程:

將待測的茶多糖配成濃度為1.0mg/mL的溶液，測定葡萄糖的含量，考察茶多糖保留率。因葡萄糖只是茶多糖中的一種，計算茶多糖含量時乘以校正系數 5.348［11］。

茶多糖的保留率(%)=W糖2/W糖1×100%

茶多糖含量(%)=W糖2/W×100%

W糖1、W糖2分別為脫蛋白前后茶多糖質量，W 為脫蛋白后茶多糖樣品的質量。

1.2.2.2 蛋白質含量測定 標準溶液配制:精確稱取牛血清白蛋白50.00mg，用少量蒸餾水溶解，定容至500mL，即為0.1mg/mL蛋白質標準液，4～5℃冰箱中保存。考馬斯亮藍G－250溶液配制:精密稱取考馬斯亮藍G－250 50.00mg，加入95%乙醇25mL，再加入85%磷酸50mL，最后用蒸餾水定容至500mL，即為0.1mg/mL的考馬斯亮藍G－250溶液，置于棕色瓶中備用。標準曲線的制作:采用考馬斯亮藍G－250法，以牛血清白蛋白作標準曲線。吸取蛋白質標準液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL 于具塞試管中，各加水至3mL，加入考馬斯亮藍G－250溶液15mL，混勻，放置10min，于595nm處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標、蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線，見圖2。蛋白質測定:將待測的茶多糖配成濃度為1.0mg/mL溶液，測定吸光度值，根據標準曲線計算剩余蛋白質含量，并計算蛋白脫除率。蛋白脫除率(%)=(W蛋白1－W蛋白2)/W蛋白1× 100%，W蛋白1、W蛋白2分別為脫蛋白前后蛋白質質量。

圖2 蛋白質標準曲線

根據吸光度與蛋白質濃度的關系，得線性回歸方程:

2 結果與討論

2.1 Sevag法脫蛋白的效果

Sevag法脫蛋白對蛋白質脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量的影響見圖3。

圖3 Sevag法脫蛋白的效果

由圖3可以看出，隨著Sevag法脫蛋白次數的增加，茶多糖溶液中蛋白質脫除率也是逐漸增加的。前3次處理中，蛋白質脫除率增加的幅度較大，從第4次開始，增加的幅度放緩，且在6次處理后蛋白質脫除率達到61.3%。同時也可以看到，隨著脫蛋白處理次數的增加，茶多糖含量也是逐漸增加的，后兩次有所降低，在處理4次的情況下，茶多糖含量達到最高74.5%。糖溶液中茶多糖的保留率是逐漸下降的，6次處理后茶多糖的保留率僅為46.1%。

Sevag法用正丁醇和氯仿能使含有蛋白的溶液乳化，使蛋白質變性而得以除去，能防止茶多糖的降解，所得茶多糖含量較高。但效率較低，需重復多次，茶多糖的損失量會較大，且氯仿是有毒物質，易造成溶劑殘留和茶多糖的活性下降。從經濟效益和安全衛生角度考慮，Sevag法不適合茶多糖的脫蛋白處理。

2.2 三氯乙酸法脫蛋白的效果

三氯乙酸法脫蛋白對蛋白質脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量的影響見圖4。

圖4 三氯乙酸法脫蛋白的效果

由圖4可以看出，隨著茶多糖液pH的增大，蛋白質脫除率逐漸增加然后較大幅度地降低，茶多糖含量也是先增加然后降低，而茶多糖溶液中茶多糖的保留率是逐漸上升的。在pH為4.0時，蛋白質脫除率達到最高68.4%，茶多糖含量最高為72.5%，此時茶多糖的保留率為66.8%。這說明pH4.0可能是日照綠茶粗多糖中雜蛋白的等電點，pH過大或過小都不利于蛋白的去除;從茶多糖保留率的變化規律也可看出，過酸的環境可能會造成茶多糖的降解增多。

三氯乙酸法是使蛋白質構象發生改變，與蛋白質形成不溶性鹽，使之聚集沉淀，除蛋白效果較好，但反應較為劇烈，易引起茶多糖的降解。無論是在蛋白質脫除率上還是在茶多糖保留率上，三氯乙酸法都要比Sevag法好一些。

2.3 鞣酸法脫蛋白的效果

鞣酸法脫蛋白對蛋白質脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量的影響見圖5。

圖5 鞣酸法脫蛋白的效果

由圖5可以看出，隨著茶多糖液pH的增大，蛋白質脫除率和茶多糖含量都是逐漸增加然后降低，不過兩者的總體水平比三氯乙酸法明顯降低，而茶多糖溶液中茶多糖的保留率是逐漸上升的，這個指標總體上比三氯乙酸法要稍高。在pH為4.0時，蛋白脫除率達到最高50.6%，茶多糖含量最高為65.3%，此時茶多糖的保留率為70.6%，也再次驗證了4.0是茶多糖粗提物中雜蛋白的等電點。

鞣酸法是利用單寧與蛋白質形成沉淀，從而除去蛋白質，反應較為溫和，這也是它在這三種方法中茶多糖保留率最高的原因，但同時也可看到，鞣酸法的蛋白質脫除率和茶多糖含量是這三種方法中最低的。

3 結論

采用Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸法對日照綠茶粗多糖脫蛋白，結果表明:Sevag法茶多糖含量較高，但茶多糖保留率較低，并且需重復多次，效率低，有毒性溶劑殘留;鞣酸法茶多糖保留率較高，但脫蛋白率和茶多糖含量較低;三氯乙酸法在蛋白質脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量三個方面的綜合指標較理想，當pH為4.0時，蛋白質脫除率達到68.4%，茶多糖保留率為66.8%，茶多糖的含量為72.5%。

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Study on deproteinization of Rizhao green tea crude polysaccharides

WANG Chuan－ming1，DONG Qi2，GUAN Cong－sheng1，*
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Shandong University，Jinan 250061，China;2.Jinan Laolaishou Biotechnology Co.，Ltd.，Jinan 250101，China)

TS201.1

B

1002－0306(2010)08－0274－03

2009－09－22 *通訊聯系人

王傳名(1984－)，男，碩士研究生，從事植物資源提取純化研究。