液相色譜—柱后衍生法測定蘋果中5種氨基甲酸酯類農藥殘留量的不確定性評定

余 星 常 薇 王詠麟 姚 曾

(四川省輕工業研究設計院有限公司，四川 成都 610084)

氨基甲酸酯類農藥作為一類新興的合成農藥，相比于傳統的有機磷類農藥，因出色的高效性和低殘留性已被廣泛應用于農業生產中[1-2]。雖然氨基甲酸酯類農藥具有刺激農作物生長作用，但同時也具有很強的毒性。因此，GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》對氨基甲酸酯類農藥在不同蔬菜中的限量進行了相應的規定。研究擬依據NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》測定蘋果中氨基甲酸酯類殘留量的測量不確定度進行分析和評定,并結合JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》的要求,對蘋果中5種氨基甲酸酯類農藥檢測結果的準確度進行分析,確定檢測過程中引入不確定度的主要影響因素,為液相色譜法測定蘋果中氨基甲酸酯類農藥殘留量的不確定度評定提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

蘋果：2021年攀枝花市東區食品安全抽檢樣品；

克百威、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、異丙威標準物質：100.0 μg/mL，曼哈格科技有限公司；

甲醇(純度為99.9%)、乙腈(純度為99.9%)、二氯甲烷(純度為99.9%)：色譜級，成都市時聯貿易有限公司；

NaOH：優級純，廣州得翔科技有限公司；

鄰苯二甲醛：99%，德國CNW 科技公司；

OPA稀釋溶液：分析純，廣州得翔科技有限公司；

巰基乙醇：分析純，上海安譜實驗科技股份有限公司；

氨基固相萃取小柱：北京振翔科技有限公司；

實驗室用水均為一級水。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津(Shimadzu)公司；

高速分散均質機：FJ200型，上海標本模型廠；

高速離心機：TGL-16C型，上海安亭科學儀器廠；

氮吹儀：UGC-45CE型，北京優晟聯合科技有限公司；

百分之一電子分析天平：JJ1000型，常熟市雙杰測試儀器廠；

超聲波清洗儀：PS-20型,深圳市潔康洗凈電器有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱為Shimadzu C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；RF-20A熒光檢測器；進樣體積10 μL； 檢測波長λex330 nm,λem465 nm；流速1.0 mL/min；運行時間27 min；柱溫42 ℃；流動相為甲醇—水；反應器溫度80 ℃；柱后衍生試劑流速0.3 mL/min。

1.4 試驗方法

稱取25.00 g樣品于勻漿機中，加入50 mL乙腈，高速勻漿2 min，過濾，濾液移至裝有7.0 g氯化鈉的100 mL 量筒中，收集50 mL濾液，手動劇烈振蕩2 min，靜置30 min，移取上層乙腈溶液10.00 mL，80 ℃水浴氮吹至近干，用2.0 mL甲醇—二氯甲烷(V甲醇∶V二氯甲烷為1∶99)溶解殘渣。凈化時先用4.0 mL甲醇—二氯甲烷(V甲醇∶V二氯甲烷為1∶99)活化氨基柱，收集洗脫液，用2.0 mL 甲醇—二氯甲烷(V甲醇∶V二氯甲烷為1∶99)溶解殘渣并過柱，重復一次，50 ℃水浴氮氣吹干，甲醇定容。過0.2 μm濾膜，上機待測。

2 結果分析

2.1 公式計算

按式(1)計算5種氨基甲酸酯類農藥在水果中的殘留量。

(1)

式中：

X——樣品中被測組分含量，mg/kg；

C——標準溶液中被測組分質量濃度，mg/L；

V1——提取溶劑總體積，mL；

V2——提取液分取體積，mL；

V3——待測溶液定容體積，mL；

f——待測溶液的稀釋系數；

m——實樣質量，g。

2.2 不確定度的來源

測定蘋果中氨基甲酸酯類農藥結果的不確定度來源于4個方面：標準物質、檢測儀器、樣品前處理過程和試驗結果分析。

3 不確定度評價

3.1 標準品引入的不確定度

3.1.3 環境溫度對容量瓶和移液管量取溶液時引入的不確定度 實驗室溫度為(20±5) ℃，經查表，乙腈膨脹系數為1.37×10-3℃-1，玻璃器皿膨脹系數為2.50×10-5℃-1[3]，乙腈膨脹系數遠大于玻璃器皿膨脹系數，因此只對溫度影響乙腈的膨脹系數結果進行計算處理，則溫度對玻璃器皿移取溶劑時引入的不確定度為：

3.1.4 標準曲線擬合引入的不確定度 克百威、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、異丙威均采取最小二乘法擬合標準溶液質量濃度—色譜峰面積曲線[4-5]，其中標準曲線方程以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，在0.050 0～1.000 0 μg/mL 質量濃度范圍內呈良好的線性關系，克百威、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威及異丙威的標準曲線線性回歸方程分別為：

Y1=1 023 884.32X1+2 664.21(R2=0.999 9)；Y2=2 085 714.22X2+8 298.33(R2=0.999 9)；Y3=1 147 173.09X3-3 270.91(R2=0.999 9)；Y4=1 034 606.75X4+8 817.64(R2=0.999 9)；Y5=1 432 506.14X5+7 206.70(R2=0.999 9)。

標準曲線擬合時的不確定度分別按式(2)～式(4)計算。

(2)

(3)

(4)

式中：

S——殘差標準偏差；

B——斜率；

n——標準溶液濃度測定的總次數；

Cx——樣品的平均質量濃度，μg/mL；

Ci——標準的質量濃度，μg/mL；

p——測定樣品總次數；

yi——第i次測得的峰面積；

a——曲線截距；

b——曲線斜率。

根據式(2)～式(4)計算出克百威、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威以及異丙威的相對標準不確定度Urel(曲)分別為0.002 5，0.017，0.015，0.026，0.022。克百威標準物品引入的總相對不確定度

同理，滅多威、3-羥基克百威、涕滅威和異丙威標準物品引入的相對不確定度分別為0.024，0.022，0.031，0.027。

3.2 檢測儀器的不確定度

3.2.1 儀器校準引入的不確定度 根據儀器中的檢定信息，其定量重復誤差RSD為0.13%(n=6)，則：

3.2.2 儀器的重復性引入的不確定度 在重復檢測樣品過程中，所測的樣品峰面積存在不同差異，采用標準不確定度的A類評定，將5種氨基甲酸酯類農藥標準物質均配制為質量濃度1.00 μg/mL，分別重復檢測6 次，測定結果見表1。

表1 5種氨基甲酸酯類農藥重復進樣結果

依據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，進樣6次，查“極差系數C及自由度V”表，極差系數C=2.53，S為6次檢測峰面積的平均值，克百威的標準不確定度為：

同理，滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、異丙威的相對標準不確定度Urel分別為0.000 77，0.001 1，0.001 1，0.000 95。因此克百威、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、異丙威引入的相對不確定度分別為0.001 2，0.000 77，0.001 1，0.001 1，0.000 95。

3.3 樣品前處理引入的不確定度

3.3.2 樣品前處理使用相關玻璃器皿引入的不確定度

3.3.3 環境溫度對容量瓶與移液管量取溶液時引入的不確定度 參考3.1.3結果，溫度對玻璃器皿移取溶劑時引入的不確定度為：

3.4 試驗結果分析引入的不確定度

樣品加標回收是試驗結果分析中不確定度的主要因素，根據GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》,當被測組分含量<0.1 mg/kg時，回收率允許范圍為60%～120%，當被測組分含量為0.1～1.0 mg/kg時，回收率允許范圍為80%～110%，試驗采取0.025 0，0.050 0，0.100 0 mg/kg 3個質量濃度作為質控樣，回收率均在80%～110%，符合國標要求。其中每個質量濃度設6次重復試驗，結果見表2和表3。

表2 樣品加標試驗結果

表3 加標回收率試驗結果

根據JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》,采用標準不確定度的A類評定貝塞爾公式計算回收率[6-7]，則5種氨基甲酸酯類農藥回收率引入的相對不確定度分別為：

3.5 相對合成標準不確定度

克百威、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、異丙威的相對合成標準不確定度為：

(5)

即5種氨基甲酸酯類農藥合成的相對合成不確定度分別為0.037，0.029，0.027，0.040，0.036。

3.6 合成標準不確定度

在相同的試驗條件下, 采用蘋果陰性樣品，加入加標量為0.100 mg/kg的5種氨基甲酸酯類農藥混標,重復進行6次試驗，其色譜圖見圖1，結果見表4。

圖1 5 種氨基甲酸酯類農藥在蘋果中的色譜圖

由表4可知，蘋果中重復測定的克百威、滅多威、3-羥基克百威、涕滅威、異丙威含量分別為0.105 7，0.107 7，0.109 2，0.103 9，0.106 1 mg/kg，其合成標準不確定度Urel(合)分別為0.003 9，0.003 1，0.002 9，0.004 2，0.003 8 mg/kg。

表4 蘋果中添加5種氨基甲酸酯類農藥的測定值

3.7 擴展不確定度

在95%置信水平下，取包含因子k為2，計算得到的擴展不確定度U擴展=Urel(合)×k，結果分別為0.007 8，0.006 2，0.005 8，0.008 4，0.007 6 mg/kg。

4 結論

通過高效液相色譜—柱后衍生法分析測定了蘋果中5種氨基甲酸酯類農藥的不確定度。結果表明，影響不確定度的主要因素為標準物質，其次為樣品回收率和樣品前處理以及檢測儀器，具體表現為Urel(標準)>Urel(回收率)>Urel(前處理)>Urel(儀器)。因此，在測定過程中需要用高精密校準的量具和標準物質，優化檢測分析方法，如控制前處理過程和儀器方法等，減小由標準物質、回收率、前處理以及儀器引入的不確定度，提高數據的準確性[8]。后續可以采用QuEChERS方法進行前處理[9]，優化前處理過程，減少溶劑的消耗，保證結果的準確性。