雙重實時熒光PCR法測定食品中大豆、小麥過敏原

金 萍 丁洪流 張 敏 金曉紅

(蘇州市產品質量監督檢驗院,江蘇 蘇州 215104)

近年來，食品過敏事件的報道處于上升趨勢[1]，這不但與社會的工業化有關，也與檢測、醫療技術的提升有密切關系。過敏原對于正常消費者來說是一種無危害的營養物質，但對于過敏患者來說是一種可能危及生命的物質，食品過敏原的管理和檢測無疑成為食品安全的熱點問題之一[2]。

對食源性過敏原的檢測研究主要從兩個領域入手：對過敏原蛋白以及物種的特異性核酸片段[3-6]進行檢測。基于過敏原蛋白特異性反應的檢測方法主要有酶聯免疫(ELISA)法[7-8]、試紙條法[9]和蛋白芯片法[10]等。ELISA法和試紙條法操作簡便，且方法的靈敏度高，目前已被許多國家接受成為標準方法，市場上也有比較成熟的商品化試劑盒產品。然而，該方法通常只能檢測一種過敏原，由于抗體生產的批間穩定性差，常產生交叉反應，容易導致假陽性結果[11]。另外，在食品加工蛋白質提取過程中會使蛋白質變性，影響抗體對抗原蛋白的特異性安靜結合能力，使得該法檢測能力下降，甚至是假陰性結果[12]。蛋白質的非免疫檢測技術還包括液相色譜(HPLC)[13]、毛細管電泳[14-15]等技術，但由于分離度不佳、無商品化標準品、靈敏度差等問題，極少被應用于過敏原的檢測工作中。

由于DNA在各種生物樣本中的高度穩定性，基于核酸的檢測方法更有優勢[16-18]。基于目的基因檢測的方法有經典PCR法[19-20]、多重PCR法[21]、環介導等溫擴增技術[22-23]以及基因芯片技術。然而，經典PCR技術一個反應體系只能檢測單一基因，檢測通量低，后期還需要電泳來區分核酸片段，對于大小相近的片段檢測容易產生誤差。多重PCR技術雖可同時擴增多重靶標，但同樣需要進行電泳檢測。基因芯片技術是將多個不連續的樣品分析過程集成到一個芯片中，實現了高通量和微量化，但檢測儀器昂貴，且對檢測人員要求較高[24-26]。研究擬建立一種能實時同步檢測食品中大豆、小麥過敏原的TaqMan探針雙重熒光PCR檢測方法，以期為食品監管部門有效管理過敏原標識提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ABITaqMan Universal PCR master mix：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

引物以及TaqMan熒光探針：生工(上海)生物工程股份有限公司；

DP304基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技公司；

植物基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技公司；

無DNA酶水：QIAGEN公司；

無水乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

大豆、小米、紅豆、玉米、水稻、大麥：大潤發超市。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機：Sorvall ST8R型，Thermo Fisher Scientific公司；

微量核酸測定儀：Epoch型，美國伯騰公司；

實時熒光PCR儀：ABI 7500型，美國ABI公司；

金屬干式恒溫儀：MK-10型，杭州奧盛公司；

組織研磨器套裝：OSE-Y30型，天根生化科技有限公司；

恒溫水浴鍋：WNB45型，美墨爾特(上海)貿易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組DNA模板制備 使用組織研磨器對大豆、小米、紅豆、玉米、水稻、大麥等樣品進行均質處理，分別過80目篩備用；為避免不同樣品間的交叉污染，不同的樣品的處理物品不通用。按照植物基因組DNA提取試劑盒要求進行核酸提取，利用Epoch微量核酸測定儀測定提取DNA的純度，DNA的純度OD260 nm/OD280 nm比率在1.7 和2.0之間滿足要求；利用Qbit測定儀測定濃度，根據使用情況，對核酸樣本進行分裝和保存。

1.3.2 特異性引物、探針的設計與合成 從Genbank數據庫中搜索獲得大豆、小麥成分的特異性核酸序列，通過軟件Meglign比對分析相近物種基因序列，選取匹配度低、差異大的序列片段，使用Primer Express 3.0以及Primer Blast等軟件工具設計獲得針對大豆、小麥成分基因的引物和不同熒光標記的探針序列，并進行特異性理論值的驗證。同時，以真核生物18S rRNA作為內參照基因確保試驗的有效性，內參基因引物探針設計來源于任易婕等[27]的相關研究。

1.3.3 多重實時熒光PCR檢測 采用25 μL擴增反應體系，反應液中包含13 μLTaqMan PCR master mix、1 μL上游引物(10 μmol/L)、1 μL下游引物(10 μmol/L)、1 μL熒光標記探針(10 μmol/L)以及3 μL模板DNA(40 ng/mL)。

反應循環參數：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40個循環反應，試驗于ABI 7500型實時熒光PCR儀上進行。

1.3.4 特異性檢測 按照DNA提取試劑盒說明書上的步驟分別提取大豆、小米、紅豆、玉米、水稻、大麥以及花生等樣品的核酸，核酸質量濃度控制在50 ng/μL左右，為確保試驗過程的有效性，多重體系中添加了真核生物18S rRNA作為內參基因。按照1.3.3中體系要求進行擴增反應，擴增完成后根據每個體系中模板DNA的擴增曲線和臨界循環值(Ct值)來確定所設計的多重熒光體系的特異性。

表1 試驗引物探針序列?

1.3.5 體系靈敏度檢測 按照1.3.1方法提取純大豆及小麥DNA，用不含DNA酶的無菌蒸餾水稀釋核酸樣本，核酸質量濃度為10.000～0.001 ng/μL。按照1.3.3中檢測體系和反應參數進行測試，確定該多重體系對于大豆及小麥DNA的核酸水平最低檢測限。

為了進一步檢測TaqMan探針多重熒光PCR檢測系統的抗干擾能力，擬制備不同質量比的混合樣進行測定。首先，將均質粉碎后的小米、紅豆、玉米、水稻以及花生這幾種常見谷物按照質量比1∶1∶1∶1∶1混合，作為檢測的干擾樣品。然后，根據表2和表3所示比例，分別將大豆和小麥與干擾樣品進行混合，作為檢測用模擬混合樣品。采用TaqMan探針的多重實時熒光PCR法測定混合樣品檢測體系的檢出限。

表2 大豆模擬DNA混合樣品

表3 小麥模擬DNA混合樣品

1.3.6 市售食品樣品中大豆、小麥過敏原檢測 進一步測試所建體系對加工樣品的檢測能力，對10種常見市售谷物食品(表4)進行大豆、小麥過敏原檢測。

表4 市售加工食品信息表

2 結果與分析

2.1 特異性試驗

由圖1可知，建立的實時熒光PCR方法對18S rRNA內參基因均有明顯的擴增信號。內參照基因的有效擴增，說明所建方法的反應過程運行正常。

圖1 7個測試樣品18S rRNA擴增結果

大豆過敏原成分檢測體系采用FAM熒光標記，小麥過敏原成分采用HEX熒光標記，由圖2(a)可知，在FAM熒光通道上，建立的方法僅對大豆樣本有明顯的擴增反應，其他樣本如小米、紅豆、玉米等均未檢測到熒光信號。由圖2(b)可知，在HEX熒光通道上，建立的方法僅對小麥樣品有明顯的擴增信號，其他樣品均未檢測到熒光信號。

圖2 特異性檢測結果

綜上，所建立的方法可特異性檢測出大豆和小麥過敏原。

2.2 靈敏度試驗

大豆和小麥過敏原DNA模板質量濃度分別為10.000，1.000，0.100，0.010，0.005，0.001 ng/μL。

由圖3(a)可知，大豆過敏原DNA質量濃度為0.01 ng/μL 時，Ct值為29.1<35.0，且擴增曲線呈典型“S”型，說明該反應體系檢測大豆過敏原的最低限度為0.01 ng/μL DNA濃度。由圖3(b)可知，在0.01 ng/μL DNA模板濃度下，小麥過敏原Ct值為29.4<35.0，擴增曲線呈典型“S”型，說明該反應體系檢測小麥過敏原的最低限度為0.01 ng/μL DNA濃度。因此，在保證特異性的前提下，TaqMan探針多熒光PCR系統對大豆和小麥中過敏原DNA的最低核酸水平檢測限均為0.03 ng。

圖3 靈敏度檢測

2.3 抗干擾試驗

根據1.3.3的體系條件對表2及表3中模擬樣本A～J進行測定，每個樣品做3個平行，樣品核酸濃度選定在40 ng/mL左右，檢測結果見表5。從表5可以看出，10.00%～0.01%的大豆和小麥模擬樣品均獲得成功擴增，Ct值分別為33.23，32.58，均<35.0。結果說明，所建立的混合檢測檢測體系均能對混樣給出正確判斷，抗干擾性號，對大豆和小麥過敏原成分可達到0.01%質量水平的檢測限。

表5 混合樣品檢測結果?

2.4 市售加工樣品檢測

采用自建的雙重熒光PCR方法對市售的10批次加工食品進行了大豆、小麥過敏原檢測。由表6可知，內參基因通道擴增正常，Ct值均<35.0，說明反應過程正常運行，檢測體系對加工食品適應良好。編號1、2、5、8以及10號樣品檢出小麥成分，而3、4、6、7、9以及10號樣品檢出大豆成分，檢測結果與樣品的標簽成分相符，說明所建方法適用于加工食品。

表6 市售加工食品檢測結果

3 結論

建立了一種基于TaqMan探針雙重熒光PCR的檢測方法，通過在同一反應管內設置內參照基因和兩種目標基因進行同步擴增，實現食品中大豆和小麥過敏原的同時檢測。所建立的方法僅對大豆和小麥過敏原DNA有特異性的擴增，最低檢測限為0.03 ng，在混合樣品的檢測中也表現出很好的抗干擾能力。相較于傳統的酶聯免疫等抗體檢測方法，更適用于大批量樣品的多成分同步篩選。相較于基因芯片等技術，操作簡便，使用成本低。該法可以為其他過敏原成分的檢測提供參考，適用于大批量樣品的篩查，具有一定的推廣價值，為食品過敏原監管提供有效依據。