時間分辨熒光免疫分析法的研究進(jìn)展及在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

蔡美玲，李登紅，農(nóng)麗松，黃光強(qiáng)，王洪濤

巴迪泰（廣西）生物科技有限公司 （廣西南寧 530031）

20 世紀(jì)60 年代初發(fā)明的標(biāo)記免疫分析法，是一種將多種生物標(biāo)記、示蹤技術(shù)與醫(yī)學(xué)免疫抗原抗體相結(jié)合而產(chǎn)生的新方法，被廣泛應(yīng)用在疾病診斷和療效觀察領(lǐng)域。目前，標(biāo)記免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay，EIA）、放射免疫分析法（radio immunoassay，RIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（electrical chemiluminescent immunoassay，ECLIA）、時間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）[1-2]。在上述方法中，TRFIA是于20世紀(jì)80年代中期發(fā)明的一種超微量熒光標(biāo)記技術(shù)，其對試驗(yàn)樣品自然熒光強(qiáng)度的影響較小，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、標(biāo)記物易生產(chǎn)、試劑使用貨架期長、無放射性化學(xué)危害、重復(fù)性好、操作方法簡便、區(qū)分度好和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，成為自放射免疫分析之后所實(shí)現(xiàn)的又一次嶄新的技術(shù)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，并且靈敏度也大大地超過了放射性同位素的最高極限（表1），是一種極具潛力的超微量檢測手段。這種靈敏度高、準(zhǔn)確性好、性能穩(wěn)定的超微量分析法，不管是對食品中有毒有害物質(zhì)的檢測，還是對環(huán)境中的痕量氣體有毒元素的測定，又或是對生物體內(nèi)各種功能抑制因子的定性分析，甚至是對人類自身疾病的診斷都具有重大意義[3]。

表1 標(biāo)記免疫分析法的檢測靈敏度

1 TRFIA 的原理及優(yōu)勢

TRFIA 的原理是以三價鑭系元素離子或其螯合物為標(biāo)記物來標(biāo)記抗體、抗原或其他各種具有生物活性的靶細(xì)胞，待反應(yīng)體系（抗原抗體反應(yīng)、生物素-親和素反應(yīng)等）發(fā)生后，用TRFIA 分析檢測器測定產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，與對照熒光強(qiáng)度進(jìn)行對比來推算出反應(yīng)體系中待測物的濃度[4-5]。

與傳統(tǒng)的免疫分析法比較，TRFIA 的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以三價鑭系元素離子或其螯合物為標(biāo)記物所具有的獨(dú)特理化特性，具體優(yōu)勢如下：（1）鑭系元素或其螯合物的熒光壽命長，是其他熒光團(tuán)的103～106倍（表2），能降低試驗(yàn)樣品或試劑本身的熒光壽命，提高靈敏度；（2）激發(fā)光和發(fā)射光的Stokes 位移大于200 nm（普通熒光Stokes 位移28 nm） （表3），能夠消除激發(fā)光和發(fā)射光的干擾；（3）鑭系元素或其螯合物熒光強(qiáng)度比值的特異性高，能有效降低各種來自不同背景光的干擾；（4）鑭系元素離子標(biāo)記物體積小，既保證了被檢測物質(zhì)的穩(wěn)定性，又能實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)標(biāo)記；標(biāo)記物穩(wěn)定，能夠?qū)?biāo)記物進(jìn)行多次激發(fā)，將熒光信號累加后取平均值的方法，大大提高了準(zhǔn)確性；（5）鑭系元素離子標(biāo)記物能夠有效保存1～2年，克服了其他免疫分析方法不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。

表2 常見熒光團(tuán)的熒光壽命

表3 鑭系元素螯合物激發(fā)光波長、發(fā)射光波長和Stokes 位移

2 TRFIA 的反應(yīng)模式

目前，TRFIA 的反應(yīng)模式目前應(yīng)用最廣泛的是夾心法和競爭法[6-7]。夾心法大多數(shù)用于測定樣品中的各種蛋白與大分子物質(zhì)，而競爭法則大多用于檢測與抗體結(jié)合的各種小分子物質(zhì)及半抗原。反應(yīng)模式流程如圖1、圖2所示。

圖1 夾心法反應(yīng)流程

圖2 競爭法反應(yīng)流程

3 TRFIA 的研究進(jìn)展

3.1 酶放大的TRFIA

1992年發(fā)明的酶放大的TRFIA 是以5-氟水楊酸磷酸酯（5-fluorosalicylate phosphate，F(xiàn)SA）作為底物，用堿性磷酸酶分子對其催化，與Tb3+相互反應(yīng)生成三元熒光絡(luò)合物（FSA-Tb3+-EDTA），在紫外光的激發(fā)條件下，即使不加增強(qiáng)液，在時間分辨熒光儀上也能夠檢測出熒光絡(luò)合物Tb3+的熒光信號[8]。趙啟仁[9]等使用酶放大的TRFIA 對核酸擴(kuò)增以及磷酸酶的熒光進(jìn)行測定，靈敏度超過10 pg 。

3.2 雙標(biāo)記及多標(biāo)記的TRFIA

在目前的熒光標(biāo)記分析法中，雙標(biāo)記及多標(biāo)記的TRFIA 仍然是獨(dú)一無二的，它充分利用鑭系離子之間不同的熒光波長和最大的熒光離子衰變持續(xù)時間的巨大差別，引入了兩種或兩種以上的鑭系離子標(biāo)記物，因此它們可以同時檢測出同一樣品中的不同化合物。常用于雙標(biāo)記的鑭系離子有Sm3+和Eu33+、Eu3+和Tb3+[10]。Xu 等[11]提出的熒光離子增強(qiáng)液分別實(shí)現(xiàn)了以上兩種雙重標(biāo)記，同時靈敏度也不受影響。多標(biāo)記測定分析技術(shù)具有省時、節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本兩大特點(diǎn)，可廣泛用于多種珍貴分子的生物篩查檢測實(shí)驗(yàn)[12-13]。

3.3 鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)的TRFIA

鏈霉親和素（streptavidin，SA）不帶糖基、等電點(diǎn)低，并且在待測物的檢測過程中的背景遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于親和素（avidin，AV），最大限度地提高了靈敏度[14]。由于SA-biotin 熒光系統(tǒng)同時可與抗原、抗體、報告酶等待測物質(zhì)反應(yīng)，使其在生物檢測系統(tǒng)中使用廣泛。1998年建立的SA-biotin 系統(tǒng)的TRFIA 技術(shù)測定人體血液中玻尿酸的含量，最低檢出限小于0.24 mg/L，并且在科研以及醫(yī)療行業(yè)，常用血液中的玻尿酸的濃度作比對。

3.4 固相的TRFIA

為了克服解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯╠issociation enhanced lauthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）的缺點(diǎn)，而建立的固相的TRFIA，它以4，7-二氯磺基苯-1，10二氮雜菲-2，9 二羧酸（4，7-bis-chorosulfophenyl-1，10-phenanthroline-2，9-dicarboxylic acid，BCPDA） 為螯合劑，連接Eu3+和多種蛋白質(zhì)，制備一種稀土元素標(biāo)記的免疫分析復(fù)合物，從而實(shí)現(xiàn)固相測定[15]。因?yàn)锽CPDA 分子結(jié)構(gòu)中含有一個部位可與Eu3+相連形成BCPDAEu3+螯合物，此螯合物本身就具有強(qiáng)化熒光的功能，所以無需額外添加熒光增強(qiáng)液，就可以直接檢測這種復(fù)合物的熒光特征信號。目前，利用這種螯合物對皮質(zhì)醇、腸腺等病毒以及茶堿開展了測試。文獻(xiàn)報道標(biāo)記的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），也是使用BCPDA 新型雙向功能螯合物，對固相的TRFIA 技術(shù)進(jìn)行研究，減少背景對熒光干擾，提高檢測熒光的靈敏度[16]。

3.5 TRFIA 與激光技術(shù)聯(lián)用

TRFIA 與激光技術(shù)聯(lián)用主要是通過脈沖激光和其他熒光特性檢測系統(tǒng)相互結(jié)合而產(chǎn)生的。7-碘-8-羥基喹啉-5-磺酸和8-羥基喹啉-5-磺酸都可以與Al、Zn、Mg、Cd 等各種金屬離子反應(yīng)形成絡(luò)合物。在不同介質(zhì)、不同增敏劑的作用下，熒光絡(luò)合物產(chǎn)生不同的熒光特性。Yu 等[17]在此基礎(chǔ)上，成功建立了一種基于Al、Zn、Mg、Cd 的聯(lián)用激光-TRFIA 測定方法。另外，將1.5 ml 0.1 mol/L 的檸檬酸鈉加入到pH=6的NaAc-HAc 緩沖體系中，檢測不到Al3+和Mg2+的熒光強(qiáng)度，而幾乎不影響Zn2+熒光的測量結(jié)果。

3.6 TRFIA 與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)連用

TRFIA 與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)相結(jié)合，簡稱PCR-TRF，使得檢測PCR 生成物更為簡便，廣泛用于與PCR 聯(lián)用的檢測方法,包括套疊式PCR-TRF、雙標(biāo)記PCR法、PCR-TRFS 直接定量法、時間分辨熒光掃PCR與TRFIA 聯(lián)用來檢測病毒的核酸[18]。研究人員開展的PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，是用Eu3+標(biāo)記寡核苷酸引物，不用進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)步驟，就能夠直接檢測，不僅優(yōu)化了操作方法，還提高了PCR 的靈敏度和特異度。

4 TRFIA 在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

4.1 在病原微生物方面的應(yīng)用

在傳染性疾病的預(yù)防檢測和治療研究領(lǐng)域中，TRFIA 應(yīng)用越來越普遍，比如，建立的TRFIA 法測試甲肝病毒（hepatitis a virus，HAV）、乙肝病毒（hepatitis b virus，HBV）、丙肝病毒、流感病毒等[19]。2005年研制出了以雙抗體夾心法的TRFIA技術(shù)，用該技術(shù)檢測新型冠狀病毒SARS-CoVN 抗原，結(jié)果顯示靈敏度達(dá)0.02 ng/ml。近年來國內(nèi)研究者建立了TRFIA 法對檢測限較低的乙肝五項(xiàng)標(biāo)志物進(jìn)行了測定，對乙型肝炎病毒感染的診斷、療效的觀察及預(yù)后的判斷有較大價值。

4.2 檢測腫瘤標(biāo)記物的水平

通過TRFIA 測定人體腫瘤標(biāo)志物的水平來檢測癌癥病變[20]，包括甲胎蛋白、癌胚抗原、糖類抗原CA125等。CA125是一種腫瘤相關(guān)抗原，許多相關(guān)疾病均可引起其升高，作為一種廣譜的標(biāo)志物，82.2%卵巢癌、58%胰腺癌、32%肺癌及其他非婦科腫瘤皆有不同程度的升高。2005年研制出的CA125時間分辨熒光免疫分析試劑盒，在0～2000 U/ml 的范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)HooK 效應(yīng)，且目前很少報道大于2000 U/ml 濃度的病例，因此大大提高了臨床診斷的可靠性；該試劑盒的靈敏度較高，可以達(dá)到1.07 U/ml；對于卵巢癌這類惡性程度很高的腫瘤來說，該試劑盒為其早期診斷、判斷療效和預(yù)后提供了重要依據(jù)。

4.3 在激素類方面的應(yīng)用

用TRFIA 檢測人類人絨毛膜促性腺激素，靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)比RIA 高，激素的免疫測定也因此獲得了重大突破[21]。目前已用TRFIA 檢測了促甲狀腺激素、人絨毛膜促性腺激素、17α-羥孕酮、前列腺激素、促黃體激素等。而目前TRFIA 不但在人血清激素的檢測中使用普遍，還常用來測定動物血清激素，比如對犬類血清中的游離甲狀腺素4（free thyroxine 4，F(xiàn)T4）進(jìn)行了測定。

4.4 用于檢測先天性甲狀腺功能低下癥

先天性甲狀腺功能不足癥是由于不可控因素使甲狀腺的發(fā)育有變或代謝產(chǎn)生功能障礙，從而無法形成相應(yīng)的甲狀腺素而導(dǎo)致生長發(fā)育緩慢，甚至智力發(fā)育遲鈍。該病在新生兒期往往不易引起家長甚至醫(yī)師的注意而延誤診斷或治療，因此影響患兒的大腦發(fā)育。目前，臨床上在檢測甲狀腺功能低下癥時多采用心電圖檢測、功能檢查、血清甲狀腺激素水平檢測等。TRFIA 法是一種可對其作出早期診斷的有效方法[22-23]，通過采用TRFIA 對患者血清做甲狀腺功能檢測，當(dāng)鑭系離子螯合物與血清里的甲狀腺激素結(jié)合時會產(chǎn)生一種膠狀分子團(tuán)，該分子團(tuán)會在紫外光激發(fā)下顯示出較強(qiáng)的熒光，能夠明顯加強(qiáng)信號值，從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4.5 用于檢測唐氏綜合征

應(yīng)用TRFIA 對妊娠孕婦的血清進(jìn)行生物標(biāo)記，進(jìn)行產(chǎn)前唐氏綜合征的篩選，是一項(xiàng)無創(chuàng)傷性的檢測手段[24]。對比早孕妊娠女性血清中的相關(guān)蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）的比例變化對研究唐氏綜合征，甚至流產(chǎn)的早期治療和監(jiān)測都有很大的實(shí)用價值。通過采用TRFIA 檢測血清中PAPP-A，結(jié)果顯示，孕早期婦女血清PAPP-A 水平隨孕周增加而呈上升趨勢（P＜0.05），隨孕婦年齡增長而呈下降趨勢（P＜.05），隨體質(zhì)量指數(shù)增加而呈下降趨勢（P＜0.05），因此，TRFIA 可作為孕早期唐氏篩查的一項(xiàng)評價指標(biāo)，對妊娠結(jié)果預(yù)判有一定參考價值。相對于傳統(tǒng)唐氏篩查，通過TRFIA 測定孕早期婦女血清PAPP-A 水平，可有效提高唐氏綜合征檢出率，且對胎兒無創(chuàng)傷，對篩查出的高危孕婦進(jìn)一步采取核實(shí)確診，避免了對所有孕早期婦女進(jìn)行有創(chuàng)檢查，從而降低了產(chǎn)前診斷的盲目性。

4.6 用于檢測寄生蟲

早在1987年就有報道使用TRFIA 和ELISA 兩種方法分別對包蟲病患者血清、其他寄生蟲患者血清及健康患者對照血清進(jìn)行測試，結(jié)果TRFIA 法的陽性檢出率可達(dá)95.1%，高于ELISA 法的81.4%，因此TRFIA 法的靈敏度高于ELISA 法。2014年，Xu 等[25]建立的TRFIA 能夠檢測華支睪吸蟲重組谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶2蛋白的抗原，靈敏度能夠達(dá)到95.80%，特異度為93.6%，與交叉反應(yīng)物質(zhì)（如血吸蟲、鞭蟲等）的交叉反應(yīng)不超過10%。

4.7 其他

TRFIA在其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中曾被廣泛用來檢測p-淀粉樣蛋白分泌抑制因子、體液中的組胺、腫瘤壞死因子等的濃度含量[11]；也有研究人員使用該技術(shù)對端粒酶的活性以及心肌類項(xiàng)目（如肌鈣蛋白T：Troponin T）進(jìn)行測定[26]。

5 總結(jié)與展望

TRFIA 技術(shù)是一種靈敏度高、特異度好、安全有效的超微量物質(zhì)分析測定方法，經(jīng)過40年的迅速發(fā)展，已成為臨床醫(yī)學(xué)檢測的主要技術(shù)手段。相信隨著生物醫(yī)學(xué)與檢測技術(shù)的迅速發(fā)展、交叉學(xué)科更深入的融合、檢測設(shè)備更加廣泛的應(yīng)用以及各種檢測試劑盒的不斷研發(fā)，TRFIA 技術(shù)將得到更進(jìn)一步的發(fā)展，推出越來越多更完善、更簡便的檢測方法，在醫(yī)療領(lǐng)域或其他領(lǐng)域發(fā)揮更大的價值。