茭白內生真菌的分離與鑒定

陳 虹，丁晨曦

（浙江樹人學院生物與環境工程學院，浙江杭州 310015）

菰[Zizania latifolia（Griseb.）Stapf]別稱茭白、茭瓜、茭筍、高瓜等，是一種在我國有著3 000 多年種植歷史的禾本科水生植物。古人采集菰的種子即菰米食用，早在我國周朝時期菰就被記為六谷之一[1]。在后來的種植過程中，菰植株被菰黑粉菌（Ustilago esculentaP.Henn）侵染后，抽穗開花受到抑制，莖部組織膨大成肉質莖，即為鮮嫩可食用的茭白，后來成為主要的蔬菜經濟作物。

菰黑粉菌是一種典型的植物內生真菌，會刺激菰植株內細胞的異常生長，使菰成為一種特殊的蔬菜。茭白作為我國第二大水生蔬菜，已有許多相關研究報道，其中菰黑粉菌在孕茭過程中的作用已被研究得較為透徹。由于菰黑粉菌的影響，茭白有3 種表現型，即正常茭、灰茭及雄茭。菰植株被菰黑粉菌侵染并成功繁殖后，其莖部膨大形成可食用的正常茭，且菰黑粉菌與茭白植株多年同生，即菰黑粉菌以菌絲型（MT型）存在；若黑粉菌潛伏周期縮短，則在茭白膨大初期，內部形成黑褐色冬孢子（T型），使得茭白潔白的肉質莖中布滿黑色斑點，這樣的茭白則稱為灰茭，一般不能食用；如果菰植株成功抵抗住了菰黑粉菌的侵入，能夠繼續開花結實，但不會長出茭白的植株稱為雄茭[2-3]。

植物內生真菌在多數情況下并不影響植物的正常生長發育，不會表現出病害癥狀。內生真菌普遍存在于植物組織內，種類較多，根據內生真菌與宿主專一性分析，平均每種植物中約有4～5 種內生真菌[4]，基于全球龐大的植物種類，可見植物內生真菌的總數量巨大。目前，內生真菌與宿主植物之間的共生機制、內生真菌天然代謝產物、對植物生長和抗病蟲害作用機制等都是研究熱點。關于茭白內生真菌的研究，一直以來對菰黑粉菌的關注較多[5]，除占夢丹從茭白植株中分離到毛霉菌和煙管菌外[6]，少有茭白中其他內生真菌的報道。本研究對正常茭白和灰茭中的內生真菌進行分離和鑒定，為茭白內生真菌的多樣性研究、內生真菌的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 植物材料

2021年12月初采自寧波市海曙區洞橋鎮百樑村水田的正常茭白2 kg和灰茭0.5 kg。

1.1.2 主要試劑

次氯酸鈉、無水乙醇、葡萄糖為市售分析純試劑，氨芐青霉素、UNIQ-10 柱式真菌基因組抽提試劑盒、真菌通用引物ITS1 和ITS4、PCR 擴增試劑盒（Taq）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 儀器與設備

光學顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司，YS 100]、PCR 儀（美國BIORAD 公司，MJ-PTC-200）、凝膠電泳儀（杭州博日科技股份有限公司，GE-100）、高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司，HVA-110）、搖床（上海蘇坤實業有限公司，SKY-2102C）。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分離培養

先將茭白樣品用實驗室流水清洗干凈，再使用無菌水沖洗3遍，次氯酸鈉消毒8 min，無菌水沖洗3遍，75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3 遍。用滅菌過的解剖刀切去茭白表皮，然后將中間部分組織切片，切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的組織切片，置于含氨芐青霉素的PDA 固體培養基上，28 ℃培養3～7 d。取最后一次沖洗茭白的無菌水涂布于PDA 平板上培養作為對照。定期觀察茭白樣品組織切片周圍是否有菌絲長出，及時轉接。采用菌絲頂端純化法對分離到的真菌進行2～3次分離純化。

1.2.2 真菌的鑒定

形態學鑒定：純化后的絲狀真菌采用插片法觀察菌絲及孢子形態，單細胞真菌直接挑取少量菌落用生理鹽水稀釋后蓋上蓋玻片鏡檢，并結合各個菌株的菌落形態，對照《真菌分類學》[7]進行形態鑒定。

內生菌株的ITS 分子鑒定：將純化的菌種接種至PDA 液體培養基培養6 d，通過抽濾、離心的方法獲得菌體。采用上海生工的UNIQ-10 柱式真菌基因組抽提試劑盒制備各菌株的基因組DNA。選擇通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），進 行PCR 擴增。PCR 反應體系為50 μL（2×Taq Mix 25 μL，DNA模板、ITS1、ITS4 各1 μL，ddH2O 22 μL）。PCR 擴增條件：94 ℃5 min；94 ℃45 s，55 ℃30 s，72 ℃10 s，30 個循環；72 ℃10 min。之后取10 μL 反應液用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。將PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結果在NCBI（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）進行序列相似性比對分析，利用MEGA7.0 軟件的NJ 法對擴增片段序列和部分已知的真菌DNA序列做進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 正常茭白與灰茭的觀察

將正常茭白及灰茭對半切開后可見兩者內部的不同（見圖1），正常茭白組織白色細膩，灰茭內部則分布著一個個黑色的冬孢子堆，取冬孢子堆粉末進行稀釋鏡檢，可以看到褐色圓形的黑粉菌冬孢子。

圖1 正常茭白、灰茭及黑粉菌冬孢子形態

2.2 真菌分離純化及形態鑒定結果

將正常茭白及灰茭經外部消毒后，組織切塊接種于PDA 平板，48 h 后隱約可見組織塊邊上有菌落及菌絲長出，至72 h 左右菌落菌絲明顯可見，此時取菌絲尖端進行分離，并多次在平板上劃線分離純化，最終篩選得到6 種形態的真菌。菌落及鏡檢照片如圖2 所示，結合菌落形態學特征及典型的菌絲特征，查詢《真菌分類學》后作出初步鑒定。

圖2 茭白中6株內生真菌的菌落及鏡檢照片

J-1～J-5 分離自正常茭白的組織，其中包括3 種酵母及2種絲狀真菌。J-1的菌落為紅色酵母樣，在最初被認為是環境污染所致，但是數次重復分離實驗中均發現此菌出現在正常茭白周邊，且作為對照的空白平板未有真菌污染，所以判斷此菌源自于正常茭白組織內。J-2 菌落潔白蓬松，經過平板插片法觀察到鐮刀形的分隔孢子，為典型的鐮刀菌屬真菌。J-3 與J-2菌一開始混合生長，經過多次分離后純化出來。J-3菌落呈絮狀，初期白色，老后變暗；背面呈褐色，插片法觀察到典型的棒狀具有縱橫隔膜的分生孢子，可確定為鏈格孢屬真菌。J-4、J-5 的菌落為乳白色酵母狀，J-4 的菌落光滑且邊緣整齊，J-5 的菌落表面有些干燥。經過鏡檢觀察，J-4 具有酵母菌橢圓形單細胞且出芽生殖的典型特征，J-5 菌株則是多個橢圓形出芽細胞連起來呈假菌絲狀。J-6 菌是源自于灰茭內部的黑粉菌孢子。對于灰茭內生真菌的分離，本實驗采取了組織切片放置培養及冬孢子稀釋涂布培養，組織切片樣本周邊生長的菌落形態單一，且與冬孢子涂布后長出來的菌落形態一致，菌落乳白色，外觀類似酵母菌落，但該菌落表面粗糙、較干燥，邊緣規則。用接種環挑取少許菌落進行稀釋鏡檢，看到細長針狀具分隔的細胞，繼續培養可產生分枝，這與李志蘭等在菰黑粉菌孢子萌發過程形態學觀察到的情況一致[8]。

2.3 茭白內生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

將6 株內生真菌提取基因組，進行ITS 序列PCR擴增后的產物交由上海生工進行測序后，所得到的結果放在NCBI 上進行Blast 比對，除J-4 菌株與最為相似的Pichia cactophila菌株的序列比對相似度為94.82%外，其余菌株與各自對比菌株的最高相似度均高于96%。將所得菌株的測序序列及Blast 網站上比對結果最相似的序列通過MEGA 7.0 軟件，采用臨近法構建系統發育樹（見圖3）。J-2、J-3、J-6 菌株與各自最相似菌株的自檢支持率為100%，J-1、J-5 菌株與其最相似菌株的自檢支持率均為99%，結合之前各個菌株的菌落特征及鏡檢到的菌絲、孢子形態特征，可以確定各自的歸屬（見表1）。J-4 菌株與最相似菌株的序列比對相似度自檢支持率僅為84%，因此無法確定到具體的屬名，只知是酵母科（Saccharomycetaceae）微生物。

圖3 茭白6株內生真菌與相關種的ITS DNA系統發育樹

表1 茭白6株內生真菌鑒定結果

3 小結與討論

本研究對正常茭白和灰茭的內生真菌進行分離和鑒定，得到鐮刀菌屬和鏈格孢屬真菌各1株，酵母菌3株，菰黑粉菌1 株。與此前占夢丹在茭白中分離到的煙管菌、毛霉菌不同，這5 種真菌均為首次檢出。在灰茭中僅分離到菰黑粉菌，未分離到別的菌株；在正常茭白中分離到其他5 種真菌。由于本實驗取樣時間在冬季，氣候寒冷，植株和微生物處于休眠期，若在生長旺盛的季節，有可能會分離到更多種類的內生真菌。冬季灰茭內部已經形成大量的黑粉菌冬孢子堆，其菌絲充滿茭白組織內，具有明顯生長優勢，其他內生真菌的含量極少。曹乾超等用切片和研磨法從正常茭白中分離出菰黑粉菌，認為采用茭白組織研磨法比切片培養法更容易分離到菰黑粉菌[9]。

內生真菌在植物中廣泛存在，從每種植物中都能分離到不同種類的內生真菌。孫璐等在毛序棘豆中分離到10 屬29 株內生真菌，其中鏈格孢屬和鐮刀菌屬是優勢菌屬[10]；魏艷妮等在遠志中分離到19 屬36 種內生真菌，不同生長年限、定殖部位的內生真菌在種類和數量上也有差異，且鐮刀屬和鏈格孢屬也是遠志內生真菌中的優勢屬[11]。陳頤輝等在化感水稻中分離到粘紅酵母和鐮刀菌[12]；裴冬麗等在銀杏根中分離到酵母和鏈格孢屬真菌[13]。可以看出，本研究從茭白中分離到的這5種真菌是植物中常見的內生真菌。

內生真菌與植物之間的關系較為復雜，多種內生真菌同時存在于植物內部，起到一定的競爭作用或者互相協調作用。除了菰黑粉菌之外，其余內生真菌在茭白孕茭中能否起到促進作用或是抑制黑粉菌的生長等，還有待于進一步研究。