生長調節劑GN-01對蛹蟲草寄生性病原真菌的誘導抗病效果

崔芙蓉，王升厚，李夢雪，柳葉飛，徐方旭*

（1.沈陽師范大學生命科學學院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽師范大學實驗教學中心，遼寧沈陽 110034）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種藥食同源真菌，含有蟲草素、蟲草酸及蟲草多糖等活性成分[1-2]。在蛹蟲草栽培過程中，白毛病危害較為嚴重，極易造成蛹蟲草子實體倒伏和矮小畸形。植物生長調節劑是人工合成或天然提取的具有激素生理活性的化合物，目前在農業生產中廣泛應用，并取得了顯著效果。本實驗對蛹蟲草栽培過程中感染的病原真菌進行分離純化及鑒定，通過侵染實驗探究植物生長調節劑GN-01對蛹蟲草寄生性病原真菌的誘導抗病作用，旨在為白毛病的控制及預防提供理論依據[3]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

不同區域發病的蛹蟲草、蛹蟲草菌株PT07（沈陽師范大學特種菌業研究所提供）、植物生長調節劑（GN-01）、真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養基和馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Broth，PDB）培養基[4]。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原真菌分離純化

刮取發病蛹蟲草上的病原真菌菌絲，采用劃線法將其接種于PDA 培養基上，25 ℃恒溫培養3～7 d；待有菌落形成時，挑取單個菌落，用點接法將其接種至PDA 培養基上繼續培養。重復上述操作，直到純化出單一菌落，于4 ℃冰箱中保存備用[5]。

1.2.2 病原真菌形態鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA 培養基上，25 ℃條件下培養至生長出完整的菌落，觀察菌落形態特征。利用光學顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態特征，參照《真菌鑒定手冊》進行形態學鑒定。

1.2.3 病原真菌分子生物學鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA 斜面上，樣品送至上海派諾森生物科技有限公司進行真菌基因組DNA提取、真菌基因組PCR 擴增、PCR 產物的回收及DNA序列的對比分析。將所得序列文件與NCBI 數據庫中的數據進行比對，構建系統發育樹。

1.2.4 病原真菌侵染蛹蟲草子實體

GN-01 稀釋濃度（均為體積濃度）分別為1∶50（2 號）、1∶100（3 號）、1∶200（4 號）、1∶500（5號）、1∶1 000（6 號）、1∶3 000（7 號）、1∶3 500（8 號）和1∶4 000（9 號），對照組（1 號）為清水。分別在蛹蟲草栽培培養基中和生長過程中加入不同稀釋濃度的GN-01，并按照蛹蟲草常規方法進行培養。

將分離所得病原真菌接種于PDB 培養基中搖瓶培養7 d，將菌體打碎，用無菌水稀釋100 倍備用。選擇生長到第35 d 的、2 種不同培養方式的蛹蟲草子實體進行病原菌侵染實驗，對照組補等量清水，在20 ℃培養55 d后測定防御酶活性及發病率。

1.3 指標檢測

1.3.1 SOD和POD酶活性測定

SOD 和POD 酶活性測定的藥品配制及實驗步驟參照文獻[6]的方法進行。

1.3.2 發病率測定

按照公式（1）計算不同實驗組別蛹蟲草總發病率。

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 病原真菌形態鑒定

分離所得病原真菌分別命名為BYJ1 和BYJ2。如圖1 所示，2 種病原真菌在PDA 培養基中生長3～7 d后，菌絲部分為白色，不透明，菌絲致密，邊緣規則；菌落顏色正反一致，生長速度較慢；菌絲分枝，有隔；有明顯成熟脫落的孢子且孢子較小，孢子直徑為3.8～4.5 μm。BYJ1 菌株菌絲寬度為2.0～5.0 μm，BYJ2菌株菌絲寬度為5.0～6.3 μm。

圖1 白毛病病原菌菌落形態

2.2 病原真菌的分子鑒定

將病原菌BYJ1 和BYJ2 所得序列進行拼接后與NCBI 數據庫中的序列數據進行比對。由圖2 可知，BYJ1 為日耳曼曲霉（Aspergillus germanicus），BYJ2 為焦曲霉（Aspergillus ustus）。

圖2 白毛病菌株鑒定系統發育樹

2.3 GN-01對蛹蟲草抗病能力的影響

2.3.1 GN-01對蛹蟲草防御氧化酶活性的影響

隨著在栽培培養基中添加或在生長過程中補加GN-01 稀釋倍數的增大，蛹蟲草子實體的SOD 和POD酶活性呈先增強后降低的趨勢，在稀釋倍數為3 000時（7 號樣品）防御氧化酶活性最高，說明蛹蟲草子實體在受到病原真菌侵害時，適當濃度的GN-01 可誘導SOD 和POD 酶活性明顯上升，以抵抗病原真菌侵害（見圖3、圖4）。

圖3 不同濃度GN-01對蛹蟲草SOD活性的影響

圖4 不同濃度GN-01對蛹蟲草POD活性的影響

2.3.2 GN-01對蛹蟲草發病率的影響

由表1 可知，在培養基中添加或在生長過程中補加稀釋50～4 000 倍的GN-01，蛹蟲草白毛病發病率呈逐漸降低趨勢。這說明蛹蟲草受到病原真菌侵害時，在栽培培養基中添加或在生長過程中補加稀釋50～4 000 倍的GN-01 可顯著減輕病原真菌的侵害，提高蛹蟲草的抗病性。

表1 不同GN-01濃度下蛹蟲草白毛病發病率

2.4 侵染實驗

根據前述預實驗結果，選擇稀釋3 000 倍的GN-01 進行病原真菌侵染抗性實驗。如圖5 所示，與對照組相比，在栽培培養基中添加和在生長過程中補加稀釋3 000 倍的GN-01，蛹蟲草子實體的發病程度均呈著減輕，與前述的預實驗結果相吻合。

圖5 不同處理方式蛹蟲草白毛病發病情況比較

3 討論與結論

植物誘導抗病性被認為是植物保護技術的新途徑。蛹蟲草自身具有一套完整的防御體系，生物或非生物脅迫都可刺激這種防御反應，因此通常將防御酶活性變化作為衡量植株防御能力的重要指標。SOD可清除自由基，延緩植物衰老；POD 可減少活性氧積累，保護膜結構完整。本實驗以在蛹蟲草培養基添加GN-01 和在生長過程中補加GN-012 種實驗所得的蛹蟲草子實體為原材料，對蛹蟲草的防御酶活性進行測定，以探究GN-01 對蛹蟲草的誘導抗病性作用。結果表明，當蛹蟲草受到病原真菌侵害時，在栽培培養基中添加或在生長過程中補加稀釋50～3 000 倍的GN-01 時，SOD 和POD 酶活性呈上升趨勢，且在GN-01稀釋倍數為3 000時，SOD 和POD 酶活性達到峰值，能有效減輕病原真菌的侵害，提升蛹蟲草的抗病性，侵染實驗結果與酶活性實驗結果吻合。

將植物生長調節劑作為病原菌抑制劑進行開發有較好的應用前景，在栽培培養基中添加或在生長過程中補加稀釋3 000 倍的GN-01，都可提高蛹蟲草相關防御酶活性，有效防治蛹蟲草寄生性病原真菌病害的發生。目前，蛹蟲草寄生性病原真菌研究體系還不完整，大部分的致病機制有待深入研究，未來應著重研究病原菌致病機制和篩選蛹蟲草優良抗病菌株。