中草藥復配農藥對莖瘤芥黑斑病菌的抑制效果

邢立剛，鄒 峰，梁 靜，張燦峰，李澤舟，羅大剛，梅 剛，馬 磊，周群文

[1.長江師范學院現代農業與生物工程學院，重慶涪陵 408000；2.重慶中邦藥業（集團）有限公司，重慶涪陵408000]

黑斑病是烏頭、冬青、薔薇、甜菜等植物的普通病害，由多種真菌所致，包括假單胞屬（Pseudomonas）細菌及多腔菌屬（Asterina）、星盾炱屬（Asterinella）、小星盾炱屬（Asteroma）、星殼孢屬（Diplotheca）、小叢殼屬（Glomerella）、日規殼屬（Gnomonia）、裂盾菌屬（Microthyriella）、扁殼黴屬（Placosphaeria）、疵黴屬（Stigmea）等真菌。莖瘤芥黑斑病是由半知菌亞門鏈格孢屬蕓薹鏈格孢侵染引起[1]，它對莖瘤芥的侵染一般發生在潮濕季節[2]，可能發生在葉或莖部，癥狀為出現圓形或不規則形黑色斑片狀病損，病斑隨著病害的持續而逐漸加深并且出現凹陷，最終形成黑色硬質斑塊，嚴重影響莖瘤芥的生長[3]。病害發展到后期嚴重時，會出現多個病斑連結成一塊大的病斑。在有機農藥出現以前，我國常使用的農藥有植物源農藥及無機農藥，只是在有機農藥出現以后，有機農藥快速占據主導地位，因為有機農藥對病蟲害的防治效果要遠強于植物源農藥和無機農藥[4]，雖然防治效果好，但會帶來環境污染、生態平衡破壞和食品安全等一系列問題，因此在開發低毒有機農藥的同時，具有安全、有效、無污染等優點的植物源農藥重新回歸人們的視野[5-7]。自然界中蘊藏大約50 萬種的植物資源[8]，許多植物具有抑菌成分，可按照不同比例復配形成植物源抑菌劑，已廣泛用于農產品的生產貯藏。植物農藥與有機農藥各有優缺點，植物農藥有安全、無污染等優點，但其防治效果遠不如有機農藥；而有機農藥則相反，防治效果好，但有環境污染、不安全等缺點。通過對不同復配比例及濃度進行試驗[9-10]，篩選出效果好、污染低、更加安全的農藥[11]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及設備

本試驗從重慶市涪陵區義和街道采集莖瘤芥的黑斑病標本，在PDA 培養基上用常規組織分離法獲得純培養。參試中藥包括貓爪草、白頭翁、千年健、五指毛桃、蟬花、蛇床子、蒙古蒿、穿心蓮、豨薟草、寬筋藤、鴨腳艾、草豆蔻、燈心草、柚核、麻黃，分別購于桐君閣大藥房和廣州采芝林國醫館有限公司北商大藥房，對照農藥為25%多菌靈。

恒溫搖床培養箱（ZHWY-2102C），高溫數顯陶瓷電熱板（C-MAG HP 7），自動壓力蒸汽滅菌器（GI54DWS），電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9245A）。

1.2 試驗方法

1.2.1 PDA培養基制備

稱取200 g 土豆加入足量超純水，煮至土豆酥軟且水量小于500 mL，各稱取20 g 葡萄糖、瓊脂，加超純水至500 mL，制成兩倍濃度PDA培養基，再分裝入2 個錐形瓶，其中1 瓶加250 mL 超純水制成正常的PDA 培養基。吸取10 mL 兩倍濃度PDA 培養基于6 支試管中，取培養皿，同時將6 支試管及200 mL 超純水一同滅菌，115 ℃下滅菌30 min[12-13]。取出后置于水浴鍋中，90 ℃保溫。空試管和培養皿滅菌烘干備用。

1.2.2 真菌復蘇

取出水浴鍋中正常PDA 培養基置于超凈工作臺，倒平板，取出莖瘤芥黑斑病真菌的菌液置于超凈工作臺，吸取50 μL 菌液加入平板中，涂均勻后封口，放入25 ℃恒溫搖床培養箱中培養，培養結束后，下次接取菌餅備用。

1.2.3 中藥提取液的制備

每種中藥稱取30 g，加入適量超純水，浸泡30 min，進行熬制，待煮沸開始計時，熬制20 min 后倒入大燒杯，共熬制3 次，用4 層紗布過濾[14]，繼續濃縮至30 mL，放入4 ℃冰箱備用[15]。

1.2.4 單味中藥與復方中藥的抑菌試驗

將試管和培養皿置于超凈工作臺，吸取中藥液和滅菌水加入試管中，制成濃度為0.2、0.6、1.0 g·mL-1的藥液10 mL，塞上棉塞取出進行90 ℃水浴加熱。將兩倍濃度PDA 培養基的試管取出，放入恒溫水浴鍋，取出2支裝培養基的試管和2支裝藥液的試管，75%酒精消毒后移入超凈工作臺，倒入培養皿之中混勻。冷卻后，切取5 mm的菌餅，向藥基中接入菌餅，用封口膜進行封口[16]。取出，置于恒溫培養箱，25 ℃倒置培養[17]。在培養結束時，采用十字交叉法測量菌落直徑[18]。

待中藥篩選完畢，通過前面單味中藥試驗結果制出復方中藥，按照比例稱取藥材，加水熬制濃縮成1 g·mL-1的中藥提取液，制成0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 g·mL-1的藥基[19]，向培養基中接入菌餅，封口，置于25 ℃恒溫培養箱倒置培養[20]，待培養結束，取出測量菌落直徑，拍照。

1.2.5 農藥的抑菌試驗

在超凈工作臺中，向試管中加入1 g 多菌靈粉劑，加入超純水至10 mL，吸取1 mL 藥液加入另一支試管中，再加入超純水至10 mL，進行梯度稀釋[21]，稀釋成0.1 mg·mL-1的稀釋液，取出PDA 培養基加熱融化，先將多菌靈稀釋液加入平皿，再將培養基加入，混勻制成1、2、4、6、8、10 μg·mL-1的20 mL 多菌靈藥基。待多菌靈藥基冷卻，切取菌餅接入藥基，方法同上。

1.2.6 復方中藥與農藥復配的抑菌試驗

以1 g·mL-1的中藥配方藥液與0.1 g·mL-1的多菌靈藥液為原液，按照1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的比例制成25 組不同比例的藥基，置于超凈工作臺中，將中藥液按照每個藥基所需要的量加入試管，取出進行水浴加熱保溫。在平皿上加入不同量的農藥溶液，取出滅菌的培養基，水浴保溫，同時取出中藥液和培養基加入含有農藥的培養皿，混勻，藥基制作完成。接入菌餅培養，培養結束后，對其菌落直徑進行測量、拍照。

2 結果與分析

2.1 單味中藥及復方中藥對黑斑病真菌的抑制效果

2.1.1 單味中藥的抑菌率

由表1可見，千年健、白頭翁、貓爪草在0.3 g·mL-1濃度下，黑斑病真菌菌絲不再生長，抑菌率達到100%；五指毛桃、蟬花在0.5 g·mL-1濃度下抑菌率達到100%；蛇床子、穿心蓮在0.5 g·mL-1濃度下抑菌率最大，在80%～90%；寬筋藤、豨薟草、鴨腳艾在0.5 g·mL-1濃度下抑菌率最大，在70%～80%；柚核、麻黃、燈心草在0.5 g·mL-1濃度下抑菌率最大，但低于60%。在李鵬祥的研究中，發現藿香的水提物、醇提物對人參黑斑病菌的抑制效果相差極大，在濃度0.01 g·mL-1時抑菌率分別為34.9%、88.2%[22]。提取方式不同，同一種藥材提取物的抑菌效果也不相同[23]，所以試驗可能存在部分藥材因提取方式不恰當導致的抑菌效果不佳[24]。

表1 單味中藥對莖瘤芥黑斑病菌的抑制率 單位：%

2.1.2 復方中藥的抑菌率

由表2可見，復方中藥濃度達0.2 g·mL-1時，對莖瘤芥黑斑病菌的抑制率已達100%；隨著復方藥濃度的降低，抑菌率也在下降，在0.2 g·mL-1濃度及以上的抑菌率均為100%。

表2 復方中藥對莖瘤芥黑斑病菌的抑制率

2.2 農藥對黑斑病真菌的抑制

25%多菌靈濃度為2 μg·mL-1時，其抑菌率為100%，表明多菌靈對莖瘤芥黑斑病真菌具有極強的抑菌效果；多菌靈濃度為1 μg·mL-1時，抑菌率為93.1%。在馬榮等關于紅棗黑斑病菌的殺菌劑研究中，發現75%百菌清等殺菌劑的EC50均高于1 μg·mL-1，其中40%氟硅唑、50%喹啉銅的EC50值低于1 μg·mL-1，其濃度達到1 μg·mL-1時抑菌效果遠低于90%[25]。25%多菌靈制成培養基對莖瘤芥黑斑病菌的抑制效果極強，需要稀釋濃度，應遠低于說明書上的濃度，可能是室內毒力與大田防治的差別，也可能是初次使用多菌靈，菌種對多菌靈的抗性極低的原因。

2.3 中藥配方與農藥復配對黑斑病真菌的抑制

在參考高小寬等關于農藥與三七復配的研究基礎上[26]，這里我們將多菌靈濃度0.0005 mg·mL-1與復方中藥濃度50 mg·mL-1分別為定義為最大濃度1∶1，復配比例如表3。結果表明，配比為3∶1 時，抑菌率最大為88.24%；配比為1∶3 時，抑菌率最大為85.29%；配比為2∶1 時，抑菌率最大為79.41%；配比為1∶2時，抑菌率最大為73.53%；配比為1∶1 時，抑菌率最大為65.88%；5 組配比中抑菌效果最好的是3∶1，最差的是1∶1，抑菌率隨著多菌靈濃度降低而下降得更快，復方中藥與農藥復配的抑菌效果下降。

表3 復方中藥與多菌靈不同復配比例下的抑菌率

3 小結與討論

通過單味中藥的抑菌試驗，發現抑菌效果最好的有千年健、白頭翁、貓爪草3種，在0.3 g·mL-1濃度時對莖瘤芥黑斑病真菌的抑菌率已達到100%；五指毛桃稍差，濃度0.3 g·mL-1時的抑菌率為88%，五指毛桃與蟬花在濃度0.5 g·mL-1時達到了100%的抑菌率；蛇床子、穿心蓮次之，在濃度0.5 g·mL-1時對黑斑病真菌同樣有很強的抑制效果，抑菌率達到80%以上；鴨腳艾、豨薟草、寬筋藤對莖瘤芥黑斑病真菌有較強的抑制效果，抑菌率在70%～80%；燈心草、麻黃、柚核，抑菌效果最差，在藥物濃度0.5 g·mL-1時的抑菌率不足50%。單獨使用貓爪草、白頭翁時，藥劑濃度從0.1 g·mL-1升到0.3 g·mL-1，其抑菌率出現跳躍式增長，可能與朱華旭等研究一樣，在用水煎和濃縮過程中出現沉淀，制作藥基時吸取上層清液，未搖晃混勻，且藥物濃度低，藥液中抑菌活性物質減少，使得抑菌效果不佳[27]。用25%多菌靈可濕性粉劑制作的藥物培養基對莖瘤芥黑斑病真菌表現出極強的抑制效果，在濃度為1 μg·mL-1時抑菌率達93.1%，藥物濃度比之中藥要低很多，但就如石志琦等認為的一樣，多菌靈作用的靶標真菌容易產生抗藥性，從而導致防治失敗[28]。復方中藥的抑菌效果比單味中藥效果要好，可能是各種中藥之間存在相互增益，使得抑菌效果增強很多，在藥物濃度為0.1 g·mL-1時抑菌率就高達96%。復方中藥和多菌靈復配所得的抑菌率比預期要差，復配的抑菌率還不如相同濃度下單獨使用時的抑菌率。

綜上所述，針對本試驗所選的中藥，可繼續進行單味中藥抑菌制劑的研究，也可從中藥毒性和降低農藥殘留兩個方面考慮，通過降低藥物濃度，研究復方中藥和農藥的復配比例，達到減毒增效復配農藥的效果。試驗結果可對莖瘤芥黑斑病復配中藥農藥、降低化學農藥殘留與污染的研究提供依據，為進一步研究奠定基礎。