慢性牙周炎患者唾液中miR-22-3p、miR-378a-3p的表達與診斷價值研究

楊貞忞,袁通穗 (.貴陽市口腔醫院口腔頜面外科,貴州 貴陽 55000;貴陽市口腔醫院牙周科，貴州 貴陽 55000)

慢性牙周炎是指發生在牙齦、牙骨質等牙齒支持組織的疾病[1]，其病理過程主要是由牙菌斑形成的齦上牙石或齦下牙石對牙周組織產生的漸進并持續的炎性破壞[2]。有研究指出，在我國牙周炎是成人失牙的主要原因，并且患病率高于齲病，這極大降低了患者的生活質量并增加了社會經濟負擔[3]。由于目前臨床上缺乏有效的治療手段，臨床上更加重視如何預防慢性牙周炎的發生及其發展[4]。但慢性牙周炎的診斷方法敏感率較低，故有大量研究通過對慢性牙周炎患者齦溝液中的一些炎癥因子或者相關基因進行檢測，以期提高該病診斷陽性率和判斷其嚴重程度[5-6]。而齦溝液存在不易采集以及容易受到污染等因素，而導致該方法存在一定局限性，單鏈非編碼微小RNA(miRNA)已經在大量研究中證實在診斷、預測疾病的預后具有一定的優勢[7-8]。本研究前期通過生物信息學方法，在GEO數據庫中挖掘在慢性牙周炎患者的唾液中表達明顯增高的miR-22-3p和miR-378a-3p，后期通過實驗驗證，擬為慢性牙周炎患者的早期診斷提供一定依據。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2019年1月～2021年6月于貴陽市口腔醫院牙周科就診的患者90例，其中牙周組織健康者22例為對照組，慢性牙周炎68例為觀察組。納入標準：①年齡≥18周歲；②除第三磨牙外余留牙≥20顆，其中有4顆磨牙；③無糖尿病等系統性疾??；④無正畸治療史；⑤6個月內未接受牙周治療；⑥女性未妊娠，未服避孕藥，且不在哺乳期、月經期。本研究經貴陽市口腔醫院倫理委員會審查批準，所有患者均簽署知情同意書。對照組中男13例，女8例；年齡18～50歲，平均32歲。觀察組又分為輕度慢性牙周炎組(23例，男13例，女10例；年齡18～52歲，平均35歲)、中度慢性牙周炎組(22例，男8例，女14例；年齡33～55歲，平均41歲)、重度慢性牙周炎組(23例，男13例，女10例；年齡39～60歲，平均49歲)。

1.2方法

1.2.1標本采集：觀察組所有患者在治療前進行唾液收集，對照組在體檢時進行唾液收集，在研究對象晨起后用表面有2%枸櫞酸的棉簽擦拭口腔，收集唾液約1 ml，在4℃離心機中3 000 r/min離心15 min，取上清液放置在-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2檢測方法：唾液miR-22-3p、miR-378a-3p的含量均采用實時熒光定量 PCR(RT-PCR)進行檢測，試劑盒購自上海百蕊生物科技有限公司，RT-PCR測量儀購自德國Qiagen公司，小型高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司。首先，提取唾液中總RNA，采用去除基因組反轉錄試劑盒，將待測標本反轉錄為cDNA，采用 RT-PCR進行檢測。本研究結果均采用2-ΔΔCt法換算miRNA的相對表達量。

2 結果

2.1觀察組和對照組miR-22-3p、miR-378a-3p水平比較:觀察組唾液中miR-22-3p、miR-378a-3p含量水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組miR-22-3p、miR-378a-3pp含量比較

2.2觀察組各亞組miR-22-3p、miR-378a-3p水平比較：重度慢性牙周炎組患者的唾液中miR-22-3p、miR-378a-3p水平高于輕度和中度慢性牙周炎組，中度慢性牙周炎組miR-22-3p、miR-378a-3p水平高于輕度慢性牙周炎組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組miR-22-3p、miR-378a-3pp含量比較

2.3觀察組miR-22-3p、miR-378a-3p含量相關性：相關性分析結果顯示，慢性牙周炎患者中，miR-22-3p與 miR-378a-3p水平呈正相關(r=0.467，P=0.019)。

2.4ROC曲線分析:采用ROC曲線評價血清 miR-22-3p與 miR-378a-3p及兩者聯合對慢性牙周炎的診斷價值，結果顯示miR-22-3p與 miR-378a-3p聯合曲線價值要優于兩者單獨診斷價值。見表3、圖1。

表3 miR-22-3p、miR-378a-3p及兩者聯合檢測 ROC曲線下面積

圖1 miR-22-3p、miR-378a-3p及兩者聯合檢測對慢性牙周炎診斷的 ROC曲線

3 討論

慢性牙周炎的病理生理特征為患者牙周組織存在持續的慢性炎癥反應，這不僅損害牙齒支持組織，部分病情嚴重的會導致牙齒脫落[9]。有研究甚至指出，隨著炎性介質和齦下的細菌在口腔中擴散，使得患者罹患部分癌癥的風險也隨之急劇增高[10]。因此，臨床上亟需通過敏感指標對于慢性牙周炎進行早期診斷和對其病情嚴重程度進行早期預測，從而通過盡早干預，以期提高慢性牙周炎的治療效果和預后。目前臨床上已有不少相關研究證實，患者外周血清或齦溝液中的白細胞介素同慢性牙周炎的疾病嚴重程度存在一定關系[11-12]。但目前臨床中仍無慢性牙周炎的特異性唾液標志物。miRNA是一類小分子非編碼RNA，其參與腫瘤、心血管疾病、神經系統和炎性疾病等多種疾病的發生發展[13]。國外學者發現大鼠牙周炎模型中外周血中miR-207、miR-495 表達上調[14]，提示miRNA同牙周炎存在一定的關系，miRNA 極有可能成為慢性牙周炎新的診斷標志物，本研究擬通過檢測患者唾液中敏感miRNA含量來診斷慢性牙周炎或者判斷其嚴重程度。

miR-22-3p被發現在冠心病動物模型中，通過靶向抑制Notch通路抑制炎性細胞因子的分泌[15]，提示miR-22-3p同炎性反應關系密切。通過對68例慢性牙周炎患者的唾液標本檢測，發現miR-22-3p含量較正常健康患者明顯升高，而且隨著慢性牙周炎病情的加劇其含量進一步增高，說明miR-22-3p同牙周炎中的炎性反應存在一定的關系。有研究發現，miR-378a-3p通過GSK-3β /β-catenin信號通路來調控口腔鱗狀細胞癌的增殖和凋亡[16]。本研究結果顯示慢性牙周炎患者的唾液中的miR-378a-3p含量升高，且同慢性牙周炎的病情呈正相關。此外，本研究結果還發現miR-22-3p和miR-378a-3p兩者含量呈正相關關系。上述結果表明miR-22-3p和miR-378a-3p可能顯著增加慢性牙周炎的患病風險，可能通過加劇炎性反應從而加劇慢性牙周炎的發生和發展。ROC曲線結果進一步顯示miR-22-3p和miR-378a-3p兩者聯合對于慢性牙周炎的診斷價值要優于兩者分別單獨診斷，這為臨床上診斷慢性牙周炎以及判斷其病情嚴重程度提供一定的理論基礎，但miR-22-3p和miR-378a-3p同慢性牙周炎患者預后的關系以及具體作用機制應進一步研究。