Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4信號(hào)通路阻斷癲癇大鼠海馬神經(jīng)元鐵死亡機(jī)制及草果知母湯的干預(yù)效應(yīng)

梁韡斌，張高煉，郭建輝，曾 敬，李 敏，陳 銳，張曉寧，劉姍姍

癲癇作為一種常見的腦部功能障礙疾病，其在我國(guó)總體發(fā)病率高達(dá)0.7%，且1年內(nèi)癲癇病人發(fā)作率為0.45%[1-2]，然而由于癲癇的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，臨床上對(duì)于癲癇的治療藥物有限且有效率低，所以加速抗癲癇藥物研發(fā)對(duì)于改善癲癇病人生活質(zhì)量具有重要意義。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)癲癇導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙與Kelch-樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)/核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶-1(HO-1)/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)通路介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡機(jī)制關(guān)系密切，且通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1/GPX4/Nrf2/HO-1通路蛋白進(jìn)而抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡成為癲癇治療的新方法[3-4]。草果知母湯作為一種中藥成方制劑，其以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，具有燥濕清熱之功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)癲癇具有顯著的改善作用[5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究草果知母湯對(duì)癲癇大鼠的改善作用及對(duì)Keap1/GPX4/Nrf2/HO-1通路的調(diào)節(jié)作用，為草果知母湯的藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)6周齡雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2009-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYKG桂2009-2005。本實(shí)驗(yàn)遵守了廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)準(zhǔn)則。

1.1.2 主要試劑 中藥草果知母湯(草果10 g，知母10 g，厚樸10 g，半夏10 g，黃芩10 g，甘草10 g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研制，批號(hào)：20150108，制備方法：將中藥飲片加水回流提取2次，第1次加10倍水提取2 h，第2次加8倍水提取1.5 h，藥液過(guò)濾、合并濃縮至含生藥濃度1 g/mL)。戊四氮(PTZ)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(貨號(hào)10106150)；丙戊酸鈉(批號(hào)201806121，賽諾菲制藥有限公司生產(chǎn))；GPX4兔多克隆抗體(貨號(hào)AF7020)、Keap1兔多克隆抗體(貨號(hào)AF7335)、HO-1兔單克隆抗體(貨號(hào)AF1333)、Nrf2(貨號(hào)AF7623)兔多克隆抗體均購(gòu)自碧云天生物科技公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)Plus超敏發(fā)光液(貨號(hào)PE0010)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào)G1120)、尼氏(Nissl)染色液(貨號(hào)G1434)、總RNA提取試劑盒(貨號(hào)R1200)、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)T2240)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào)A0208)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽(GSH)(貨號(hào)ARB10949)及活性氧(ROS)(貨號(hào)ARB14150)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；鐵含量檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)MBC4350)購(gòu)自北京麥瑞博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、草果知母湯低、中、高劑量組和西藥對(duì)照組，每組10只。參照文獻(xiàn)[6]方法腹腔注射PTZ 40 mg/kg，隔日1次，連續(xù)1個(gè)月，造模期間每次注射完畢后觀察1 h，并按照大鼠生理反應(yīng)及表現(xiàn)進(jìn)行Racine分級(jí)，連續(xù)3次出現(xiàn)全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作即判定造模成功，此后PTZ給藥由隔日1次改為每3 d 1次，以維持造模狀態(tài)。依據(jù)臨床給藥劑量，按照體表面積進(jìn)行折算，草果知母湯低、中、高劑量組分別給予草果知母湯1.25 g/kg、2.50 g/kg、5.00 g/kg灌胃；西藥對(duì)照組給予腹腔注射丙戊酸鈉(200 mg/kg)[7]，每日1次；模型組及正常對(duì)照組給予腹腔注射生理鹽水，連續(xù)給藥5周。

1.2.2 Racine評(píng)分 末次給藥24 h后對(duì)大鼠進(jìn)行Racine評(píng)分，0分：無(wú)抽搐發(fā)作；1分：耳、面部抽搐；2分：肌陣攣，但無(wú)直立位；3分：肌陣攣，伴直立位；4分：全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作；5分：全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，并失去體位控制。

1.2.3 海馬組織GSH、ROS水平及鐵含量檢測(cè) 取大鼠海馬組織裂解勻漿，4 ℃，8 000 r/min，離心10 min，取上清，使用GSH、ROS水平及鐵含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定GSH、ROS水平及鐵含量。

1.2.4 HE及Nissl染色病理學(xué)觀察 取大鼠海馬組織于中性甲醛中固定后石蠟包埋，4 μm切片，采用HE及Nissl染色試劑盒進(jìn)行常規(guī)HE及Nissl染色，觀察大鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)改變，并根據(jù)Nissl染色結(jié)果對(duì)海馬CA1區(qū)進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTq-PCR)檢測(cè)海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平 取大鼠海馬組織，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1及GAPDH引物序列進(jìn)行RTq-PCR反應(yīng)，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1相對(duì)表達(dá)量。各基因引物序列見表1。

表1 各基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列

1.2.6 免疫組化法 取海馬組織切片，脫蠟水化后用30%過(guò)氧化氫(H2O2)孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，然后用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3 min。將切片在10%的山羊血清中室溫孵育20 min，以阻斷非特異性結(jié)合，分別與GPX4、Nrf2兔抗體在室溫下孵育1 h，再次用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用二抗室溫孵育30 min，切片經(jīng)DAB染色、蘇木素復(fù)染、脫水、干燥后光鏡觀察，用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算蛋白表達(dá)積分光密度(IOD)值。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot) 用組織裂解緩沖液提取大鼠海馬組織總蛋白，用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。從每個(gè)樣品中取50 μg蛋白，并將其電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用10%脫脂奶粉室溫封閉1 h。然后用Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1和GAPDH抗體(1∶500稀釋)在4 ℃孵育過(guò)夜，次日在洗滌液中沖洗3次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h，再次洗滌后滴加化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中成像并使用Image J軟件定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 草果知母湯可降低癲癇大鼠Racine評(píng)分 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠Racine評(píng)分升高(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對(duì)照組Racine評(píng)分降低(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量增加，大鼠Racine評(píng)分逐漸降低(P<0.05)。詳見圖1。

模型組與正常對(duì)照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲P<0.05。

2.2 草果知母湯可升高癲癇大鼠海馬組織GSH水平，降低ROS水平及鐵含量 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織GSH水平降低(P<0.05)，鐵含量及ROS水平升高(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對(duì)照組GSH水平升高(P<0.05)，鐵含量及ROS水平降低(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量增加，大鼠海馬組織GSH水平逐漸升高，鐵含量及ROS水平逐漸降低。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬組織ROS、GSH水平及鐵含量比較(±s)

2.3 草果知母湯保護(hù)癲癇大鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)正常，未見病理性改變；與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織CA1區(qū)炎癥浸潤(rùn)，神經(jīng)元缺失，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對(duì)照組大鼠海馬組織病理學(xué)恢復(fù)，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。大鼠海馬組織CA1區(qū)HE、Nissl 染色檢測(cè)結(jié)果見圖2、圖3。各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)比較見圖4。

圖2 大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果(×400)

圖3 大鼠海馬CA1區(qū)Nissl 染色結(jié)果(×400)

2.4 草果知母湯可降低癲癇大鼠海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平降低(P<0.05)，Keap1 mRNA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對(duì)照組GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平升高(P<0.05)，Keap1 mRNA水平降低(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量增加，大鼠海馬組織GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平逐漸升高，Keap1 mRNA水平逐漸降低。詳見表3。

模型組與正常對(duì)照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲P<0.05。

表3 各組大鼠海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA水平比較(±s)

2.5 草果知母湯抑制癲癇大鼠海馬CA1區(qū)GPX4、Nrf2蛋白表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)GPX4、Nrf2蛋白表達(dá)積分光密度降低(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對(duì)照組海馬CA1區(qū)GPX4、Nrf2蛋白表達(dá)積分光密度升高(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量增加，GPX4、Nrf2蛋白表達(dá)積分光密度逐漸升高。詳見圖5～圖8。

圖5 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)GPX4蛋白表達(dá)

模型組與正常對(duì)照組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△ P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲ P<0.05。

圖7 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)Nrf2蛋白表達(dá)

模型組與正常對(duì)照組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△ P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲ P<0.05。

2.6 草果知母湯可抑制癲癇大鼠海馬組織Keap1、GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Keap1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，草果知母湯各劑量組及西藥對(duì)照組GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Keap1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。隨著草果知母湯劑量的增加，大鼠海馬組織GPX4、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)逐漸升高，Keap1蛋白表達(dá)逐漸降低。詳見圖9。

模型組與正常對(duì)照組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與草果知母湯低劑量組比較，△P<0.05；與草果知母湯中劑量組比較，▲ P<0.05。

3 討 論

癲癇是由于大腦神經(jīng)元異常放電進(jìn)而導(dǎo)致大腦功能障礙的一種慢性疾病，然而，癲癇發(fā)作時(shí)臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，其發(fā)病機(jī)制也不盡相同，所以目前臨床對(duì)于癲癇的治療方法有限，研發(fā)新型抗癲癇藥物是目前臨床的迫切需求。癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元異常放電會(huì)引起海馬神經(jīng)元損傷，進(jìn)而可能導(dǎo)致癲癇病人繼發(fā)認(rèn)知功能障礙等疾病。嚴(yán)建文[8]研究報(bào)道了癲癇大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞減少，同時(shí)海馬組織促凋亡基因表達(dá)升高；蔡棟梁等[9]同樣報(bào)道了癲癇大鼠海馬組織病理性改變并發(fā)生明顯神經(jīng)元凋亡。因此，在癲癇的治療中，海馬神經(jīng)元的保護(hù)及修復(fù)是重要的治療途徑之一。丙戊酸鈉是目前藥理機(jī)制明確且臨床應(yīng)用廣泛的治療癲癇的藥物，所以，本實(shí)驗(yàn)用其作為陽(yáng)性對(duì)照組藥物。

中醫(yī)理論認(rèn)為癲癇歸屬于“癡呆”“癇癥”“癲癥”等范疇，其病因與病人痰濁內(nèi)生及情緒失調(diào)等因素有關(guān)。“癇為痰蓄，無(wú)痰不作癇”，同時(shí)指出癲癇伴認(rèn)知障礙的病機(jī)關(guān)鍵在于“腎精虧虛、風(fēng)痰閉阻”。草果知母湯是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下由草果、知母等中藥材組成的中藥成方制劑，其最早記載于中醫(yī)學(xué)著作《溫病條辨》中，具有燥濕清熱的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，草果知母湯對(duì)癲癇動(dòng)物模型有顯著改善作用，甘賢兵等[10-11]先后研究發(fā)現(xiàn)草果知母湯及其加減方能夠通過(guò)提高腦內(nèi)γ-氨基丁酸(GABA)陽(yáng)性神經(jīng)元分布及受體表達(dá)進(jìn)而抑制大鼠癲癇的發(fā)作及進(jìn)展，同時(shí)能夠降低大鼠驚厥發(fā)作級(jí)別。張麗萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，草果知母湯能夠抑制癲癇引起的大鼠腦海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變。然而，草果知母湯對(duì)于癲癇的治療作用機(jī)制及其對(duì)鐵死亡的抑制作用目前尚不清楚。

鐵死亡是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡方式，其機(jī)制為細(xì)胞在金屬元素鐵的參與下發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物和致命性反應(yīng)ROS積聚導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，呈現(xiàn)出鐵離子依賴性[13]。許璐等[14]研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡激活劑能夠誘導(dǎo)小鼠海馬HT22細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS及鐵含量升高，同時(shí)抑制海馬組織細(xì)胞內(nèi)鐵含量及ROS水平，從而增強(qiáng)海馬細(xì)胞活力，其機(jī)制可能與提高海馬HT22細(xì)胞內(nèi)HO-1水平有關(guān)。楊田麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)HT22細(xì)胞內(nèi)鐵含量及脂質(zhì)過(guò)氧化物水平升高則明顯促進(jìn)HT22細(xì)胞凋亡。曾勁松等[16]研究表明神經(jīng)元鐵超載導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，其機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)鐵含量升高進(jìn)而導(dǎo)致GSH水平、GPX-4活性降低及ROS水平升高有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，草果知母湯能夠明顯抑制癲癇大鼠海馬組織鐵含量及ROS水平，并升高海馬組織GSH水平，且隨著草果知母湯劑量的增加，海馬組織鐵含量及ROS水平明顯降低，海馬組織GSH水平升高更明顯。

研究表明，細(xì)胞內(nèi)Nrf2能夠抑制細(xì)胞內(nèi)氧自由基的活性，修復(fù)細(xì)胞損傷[17]。在細(xì)胞正常狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)Nrf2與Keap1特異性結(jié)合，Nrf2的活性受到抑制，但細(xì)胞損傷時(shí)，Keap1與Nrf2發(fā)生解離，Nrf2被激活，進(jìn)而激活下游HO-1及GPX-4水平，增強(qiáng)組織抗氧化能力，保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。HO-1作為重要的抗氧化酶，在外界刺激及細(xì)胞因子引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用[18]。同時(shí)，研究表明，鐵死亡誘導(dǎo)劑可直接或間接作用于GPX4，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS堆積、觸發(fā)細(xì)胞氧化死亡機(jī)制[19]。GPX4和Nrf2分別通過(guò)限制ROS產(chǎn)物和降低細(xì)胞內(nèi)鐵的攝取對(duì)鐵死亡發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用[20]，因此，GPX4和Nrf2被認(rèn)為是海馬組織鐵死亡的直接相關(guān)性蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，草果知母湯各劑量組能夠呈劑量依賴性降低大鼠海馬組織Keap1 mRNA及蛋白水平，并升高Nrf2、GPX4及HO-1 mRNA及蛋白水平。

綜上所述，草果知母湯能夠修復(fù)癲癇大鼠海馬組織氧化損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/HO-1/GPX4通路進(jìn)而阻斷海馬神經(jīng)元鐵死亡有關(guān)。