皮質(zhì)抑素通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路抑制急性心肌梗死后心力衰竭大鼠氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡

顧 崢，王顧浩，劉 戀

目前，世界范圍內(nèi)心力衰竭(heart failure，HF)病人已超過(guò)2300萬(wàn)例，其發(fā)病率仍在持續(xù)上升。雖然近30年來(lái)心力衰竭的治療取得了很大進(jìn)步，但心力衰竭病人5年死亡率仍高達(dá)50%[1]。心力衰竭的一個(gè)常見原因是急性心肌梗死(acuate myocardial infarction，AMI)。AMI通常預(yù)示著心功能不全的開始，由于心肌損傷、反復(fù)缺血、心肌頓抑和冬眠、心室重塑和慢性神經(jīng)內(nèi)分泌刺激等原因，AMI最終可能發(fā)展為心力衰竭[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，急性心肌梗死住院病人的心力衰竭發(fā)病率介于14%～36%[3]。因此，開發(fā)關(guān)于心力衰竭新的治療藥物對(duì)于改善急性心肌梗死后心力衰竭(post-acuate myocardial infarction heart failure，HF-AMI)疾病現(xiàn)狀有重要意義。皮質(zhì)抑素(cortistatin，CST)是一種含有FWKT (Phe-Trp-Lys-Thr)四聚體的小分子生物活性肽，廣泛分布于神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)。皮質(zhì)抑素及其受體也廣泛分布于心血管系統(tǒng)，如主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈和心臟。許多研究表明，皮質(zhì)抑素具有調(diào)節(jié)睡眠、學(xué)習(xí)記憶、誘導(dǎo)免疫耐受、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌代謝等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明皮質(zhì)抑素在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，如皮質(zhì)抑素通過(guò)阻斷細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2信號(hào)通路抑制腹主動(dòng)脈瘤小鼠巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制細(xì)胞凋亡，從而抑制腹主動(dòng)脈瘤的產(chǎn)生[5]； 皮質(zhì)抑素可減少頸動(dòng)脈、心臟、主動(dòng)脈弓和主動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的數(shù)量和大小，抑制Th1/Th17誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而抑制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化[6]。此外，已有研究表明，伊伐布雷定通過(guò)抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡，改善糖尿病心肌病小鼠心功能障礙[7]。目前，關(guān)于皮質(zhì)抑素對(duì)HF-AMI的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在探究皮質(zhì)抑素對(duì)HF-AMI后心臟的保護(hù)作用，并明確其心臟保護(hù)機(jī)制是否與p38 MAPK信號(hào)通路和心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 40只雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量為220～250 g，購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大鼠皮質(zhì)抑素-14肽購(gòu)自美國(guó)Phoenix Pharmaceuticals Inc公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)試盒(羥胺法)、活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法)購(gòu)自南京建成生物工程研究所；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶-6(p-MKK6)抗體、絲裂原活化蛋白激酶激酶-6(MKK6)抗體、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；二維M型和B型超聲診斷儀購(gòu)自加拿大Visual Sonics；PowerLab ML880系統(tǒng)購(gòu)自澳大利亞AD公司；熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek。

1.2 HF-AMI動(dòng)物模型制備[8]及給藥處理 40只SD大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，提供充足的飲水及飼料，待大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、皮質(zhì)抑素高劑量組(CST-H組)和皮質(zhì)抑素低劑量組(CST-L組)，每組10只。1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，劑量為50 mg/kg，仰臥位，氣管插管，連接呼吸機(jī)、麻醉劑及心電監(jiān)護(hù)儀。模型組、CST-H組和CST-L組大鼠無(wú)創(chuàng)性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，隨后可見結(jié)扎線下方心肌顏色發(fā)白、心電圖出現(xiàn)ST-T及Q波，此時(shí)HF-AMI動(dòng)物模型建立成功。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行穿線，但不結(jié)扎。CST-H組和CST-L組大鼠腹膜內(nèi)分別注射皮質(zhì)抑素175.0 mg/(kg·d)和87.5 mg/(kg·d) ，假手術(shù)組和模型組大鼠腹膜內(nèi)注射等量生理鹽水，持續(xù)給藥1周。

1.3 超聲心動(dòng)圖 1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，通過(guò)二維M型和B型超聲心動(dòng)圖評(píng)估左心室功能，監(jiān)測(cè)左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、收縮分?jǐn)?shù)(FS)。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量 超聲心動(dòng)圖檢查后，進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)量以評(píng)估左心室(LV)功能。 使用PowerLab ML880系統(tǒng)記錄平均血壓(MBP)、左心室壓力的最大升高速率(+dp/dtmax)和左室壓力的最大降低速率(-dp/dtmax)。

1.5 蘇木素-伊紅(HE) 染色 戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取出心臟，用4%多聚甲醛固定左心室組織72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水洗滌后，伊紅液浸染3 min。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

1.6 ROS、超氧化物歧化酶(SOD)和MDA檢測(cè) ROS檢測(cè)：大鼠持續(xù)給藥1周后，取出心臟。剪碎心臟后，0.25%胰酶消化心臟組織，1 000 r/min離心5 min，棄上清。含20%胎牛血清(FBS)的DMEM終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入新鮮含20%FBS的DMEM，靜置10 min后，離心棄上清。含20%FBS的DMEM重懸細(xì)胞，過(guò)100目篩網(wǎng)，離心棄上清。2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×106個(gè)/mL。根據(jù)ROS測(cè)定試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)組織ROS含量。

SOD和MDA的檢測(cè)：大鼠持續(xù)給藥1周后，收集大鼠腹主動(dòng)脈血液樣本，3 000 r/min離心10 min，收集血清，根據(jù)T-SOD測(cè)試盒和MDA測(cè)定試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)大鼠血清中SOD和MDA含量。

1.7 TUNEL染色 按照方法1.5進(jìn)行心臟取材及石蠟切片制備。心肌石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗后，3%過(guò)氧化氫(H2O2)浸洗10 min，加入蛋白酶K工作液，37 ℃反應(yīng)20 min，PBS漂洗后，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，濕盒中37 ℃孵育1 h。PBS漂洗，加入轉(zhuǎn)化劑，濕盒中37 ℃孵育20 min。PBS漂洗，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察分析。

1.8 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)法 戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取出心臟，把心臟組織剪切成細(xì)小的碎片，RIPA裂解液裂解組織，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，隨后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入Bcl-2(1∶2 000)抗體、Bax(1∶2 000)抗體、p-MKK6(1∶5 000)抗體、MKK6(1∶3 000)抗體、p-p38 MAPK(1∶2 500)抗體、p38 MAPK(1∶2 500)抗體和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(1∶5 000)抗體，4 ℃條件下過(guò)夜孵育。加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 皮質(zhì)抑素對(duì)HF-AMI大鼠心功能及血流動(dòng)力學(xué)的影響 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠心功能，結(jié)果見圖1A。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVEDD和LVESD明顯升高(P<0.05)，EF和FS明顯降低(P<0.05)，MBP、+dp/dtmax和-dp/dtmax值明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組大鼠LVESD明顯降低(P<0.05)，EF和FS明顯升高(P<0.05)，MBP、+dp/dtmax和-dp/dtmax值明顯升高(P<0.05)，其中CST-H組大鼠變化更為顯著。詳見圖1B、圖1C。

注：1 mmHg=0.133 kPa；與假手術(shù)組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.2 皮質(zhì)抑素對(duì)HF-AMI大鼠心肌病理組織學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌排列整齊，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組大鼠心肌排列紊亂，心肌組織大面積壞死并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組大鼠心肌排列趨于整齊，其中CST-H組大鼠變化更明顯。詳見圖2。

圖2 各組HF-AMI大鼠心肌病理組織學(xué)變化(×400)

2.3 皮質(zhì)抑素對(duì)HF-AMI大鼠ROS、SOD和MDA水平的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠MDA和ROS含量明顯升高(P<0.05)，SOD含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組MDA和ROS含量明顯降低(P<0.05)，SOD含量明顯升高(P<0.05)，其中，CST-H組變化更明顯。詳見圖3。

與假手術(shù)組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 皮質(zhì)抑素抑制HF-AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡 TUNEL染色和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)，其中CST-H組大鼠變化更明顯。詳見圖4。

與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.5 皮質(zhì)抑素可抑制HF-AMI大鼠p38 MAPK通路 Western Blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠p-MKK6/MKK6和p-p38 MAPK/p38 MAPK表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，CST-H組和CST-L組大鼠p-MKK6/MKK6和p-p38 MAPK/p38 MAPK表達(dá)明顯降低(P<0.05)，其中CST-H組變化更明顯。詳見圖5。

與假手術(shù)組比較，＊P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討 論

HF-AMI是一種全身性疾病。挪威心血管病項(xiàng)目的數(shù)據(jù)顯示，2001年—2009年共有86 771例首次AMI病人，其中18.7%的病人在住院期間出現(xiàn)或發(fā)生心力衰竭，心力衰竭的發(fā)生率隨年齡增長(zhǎng)而增加[9]。研究表明，細(xì)胞凋亡在AMI后的心功能不全和結(jié)構(gòu)改變中起重要作用，并參與左室重構(gòu)和心功能不全的發(fā)展過(guò)程，直至出現(xiàn)癥狀性心力衰竭[10]。因此，抗凋亡被認(rèn)為是一種改善心力衰竭的可能方式。近年來(lái)，生物活性肽在預(yù)防和治療心血管疾病方面引起了越來(lái)越多的關(guān)注。內(nèi)皮抑素作為一種小分子生物活性肽，具有調(diào)節(jié)睡眠與學(xué)習(xí)記憶、誘導(dǎo)免疫耐受、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌代謝等多種生物學(xué)效應(yīng)。此外，內(nèi)皮抑素在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[4]。因此，本研究旨在探究?jī)?nèi)皮抑素對(duì)HF-AMI的作用及對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，以期為明確內(nèi)皮抑素在HF-AMI的作用機(jī)制及開發(fā)新的治療藥物提供理論依據(jù)。

有研究在探究?jī)?nèi)皮抑素與主動(dòng)脈鈣化的關(guān)系及其機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑素可能通過(guò)糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和蛋白激酶C(PKC)信號(hào)通路抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化和大鼠動(dòng)脈鈣化[11]。有證據(jù)顯示，外源性內(nèi)皮抑素通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠急性心肌梗死后心功能，具有明顯的心肌保護(hù)作用[12]。內(nèi)皮抑素可抑制環(huán)孢素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[13]。另有研究表明，內(nèi)皮抑素可抑制腹主動(dòng)脈瘤小鼠的ROS水平[5]。本研究顯示，內(nèi)皮抑素可改善HF-AMI大鼠心功能和血流動(dòng)力學(xué)障礙，改善心肌組織病理學(xué)變化，抑制心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

p38 MAPK通路參與心臟疾病的發(fā)生發(fā)展，研究表明，心肌肥厚大鼠p38 MAPK磷酸化水平與正常大鼠相比上調(diào)；環(huán)維黃楊星D通過(guò)抑制p38 MAPK磷酸化水平，減輕心肌肥厚大鼠左室肥厚，改善組織病理學(xué)、血流動(dòng)力學(xué)和心功能[14]。銀杏葉提取物通過(guò)抑制p38 MAPK通路抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥，減少AMI小鼠梗死面積[15]。近年來(lái)，研究表明，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移參與了動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄和移植性血管病等血管疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。內(nèi)皮抑素通過(guò)抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和ERK5信號(hào)通路在血管緊張素Ⅱ刺激的血管平滑肌細(xì)胞中發(fā)揮抗增殖和抗遷移作用[17]。以上研究結(jié)果說(shuō)明，內(nèi)皮抑素可能通過(guò)抑制p38 MAPK通路，在心血管疾病中發(fā)揮作用。本研究顯示，HF-AMI大鼠p38 MAPK磷酸化水平與正常大鼠相比明顯上調(diào)，而內(nèi)皮抑素可下調(diào)HF-AMI大鼠p38 MAPK磷酸化水平，該結(jié)果表明內(nèi)皮抑素通過(guò)抑制p38 MAPK通路活化在HF-AMI中發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，內(nèi)皮抑素通過(guò)抑制p38 MAPK通路抑制HF-AMI大鼠氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，從而在HF-AMI中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究為探明內(nèi)皮抑素在HF-AMI中的作用機(jī)制及開發(fā)新的HF-AMI治療藥物提供了新的科學(xué)依據(jù)。