基于網絡藥理學和分子對接技術探討升陷湯治療冠心病的作用機制

張子浩，郗瑞席，徐 浩，3

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)簡稱冠心病，作為我國十大慢性病之一，盡管西醫標準化治療貫穿始終，但仍然有阿司匹林抵抗、介入治療后再狹窄等藥物和支架等不能解決的問題，中醫藥在其中發揮了重要作用[1]。冠心病病人聯合服用中藥，可有效緩解癥狀，減少藥物副作用，延緩疾病進展[2]，但其作用機制尚不明確，也成為近年來研究的熱點。

冠心病屬中醫學“胸痹”范疇，證屬本虛標實，本虛以氣虛為主，標實以血瘀為主[3]。升陷湯出自《醫學衷中參西錄》，由生黃芪、知母、柴胡、升麻、桔梗5味藥組成，主治胸中大氣下陷證。胸中大氣即宗氣，張錫純謂其“不但為諸氣之綱領，并可為周身血脈之綱領”[4]，宗氣虧虛則氣血運行不暢，日久導致血液瘀滯，發為胸痹。升陷湯益氣升陷，可使氣血運行歸于正常，臨床廣泛用于治療冠心病等心血管疾病。大量臨床研究顯示，以升陷湯為基礎方治療冠心病的療效顯著[5]。現代藥理學研究表明，升陷湯可以通過抑制細胞凋亡、降低細胞內活性氧(ROS)以及Ca2+的濃度等機制減輕缺血缺氧對心肌細胞的損傷[6]。

網絡藥理學通過大數據搜索，構建并分析生物分子網絡，探索藥物對于疾病的影響。本研究利用中藥復方網絡藥理學探討升陷湯治療冠心病可能的網絡靶標與作用機制，為后續研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 升陷湯活性成分的篩選和靶點預測 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)[7]，分別以黃芪、知母、柴胡、升麻、桔梗為關鍵詞，設置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，檢索升陷湯的活性成分，并根據已發表文獻進行補充，通過TCMSP預測各成分的作用靶點。

1.2 疾病靶點獲取 在疾病基因數據庫Genecards(https://www.genecards.org)[8]、TTD(https://db.idrblab.net/ttd)[9]、DrugBank(https://go.drugbank.com)[10]中以“coronary heart disease”為檢索詞進行檢索，將結果合并去重后，導入UniPort數據庫(https://www.uniprot.org)標準化靶點名稱，得到冠心病靶點。

1.3 藥物和疾病共同靶點的篩選 將疾病靶點與藥物靶點導入Excel表格進行比對，篩選兩者交集基因，獲得升陷湯治療冠心病的作用靶點，并通過微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)在線繪制Venn圖。

1.4 “成分-靶點”網絡構建 將活性成分與作用靶點導入Cytoscape 3.8.2構建“成分-靶點”網絡，使用Network Analyzer進行拓撲分析，計算連接度(degree)預測關鍵成分。

1.5 蛋白質互作(PPI)網絡構建 將交集靶基因導入STRING(https://string-db.org)數據庫，種族選擇Homo sapiens，將置信度設置為0.9，去除游離靶基因，得到PPI網絡，并用Cytoscape 3.8.2進行優化，通過節點連接度篩選核心靶點。

1.6 富集分析 利用Metascape平臺(https://metascape.org/gp/index.html)對交集靶點進行基因本體(GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析，結果通過微生信平臺在線進行可視化。

1.7 分子對接 選擇連接度排名前5位的化合物及靶點進行分子對接。在TCMSP平臺中搜索化合物結構，保存為mol2文件。將關鍵靶點導入PDB數據庫(http://www.rcsb.org/)，通過放射度(R值)篩選得到對應的靶點蛋白，保存蛋白結構為pdb文件。將mol2及pdb文件導入CB-Dock平臺(http://cao.labshare.cn/cb-dock/)在線對接和可視化，通過對接分數值來評價其結合活性。

2 結 果

2.1 升陷湯活性成分及其靶點獲取 利用TCMSP平臺及文獻[11-14]共篩選到46種活性成分(黃芪12種，柴胡10種，知母9種，桔梗4種，升麻6種，5種共有成分)和263個靶點，活性成分見表1。

表1 升陷湯活性成分

2.2 冠心病相關靶點檢索 通過GeneCards、DrugBank、TTD分別得到7 100個(選取score值前1/4的靶點為1 777)、68個、2個冠心病靶點，合并去重后得到1 797個靶點。

2.3 藥物和疾病共同靶點的獲取 使用Excel表格篩選得到158個藥物和疾病交集靶點，將藥物作用靶點和冠心病相關靶點導入微生信平臺，繪制Venn圖，見圖1。

圖1 藥物靶點和疾病靶點分布圖

2.4 “成分-靶點”網絡構建 網絡共包含210個節點(158個靶點、46個活性成分、5個中藥、1個代表冠心病)與1 039條邊，見圖2。degree代表網絡中與該節點相互作用的節點數量，度值越高提示該節點在網絡中作用越關鍵。網絡中，槲皮素、山奈酚等活性成分度值較高，可能是升陷湯治療冠心病的關鍵成分。詳見表2。

圖2 成分-靶點網絡圖

表2 關鍵活性成分

2.5 PPI網絡構建 利用STRING數據庫對158個交集基因進行PPI分析，設置閾值>0.9，隱藏游離基因，結果導入Cytoscape 3.8.2繪制PPI網絡圖(見圖3)。該網絡包含137個節點、646條邊，度值較高的基因有信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、蛋白激酶(AKT)1、JUN原癌基因(JUN)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、腫瘤蛋白P53(TP53)等。

圖3 PPI網絡圖

2.6 GO生物過程及KEGG通路富集分析 利用Metascape平臺對158個作用靶點進行GO和KEGG富集分析，選取P值前20位的結果繪制氣泡圖(見圖4～圖7)。GO富集結果顯示，交集基因與對毒性物質反應、應對受傷、對無機物質的反應等生物學過程，膜筏、膜微結構域、膜區域等細胞組分，蛋白質結構域特異性結合、蛋白激酶綁定、激酶綁定等分子功能關系密切。KEGG富集結果顯示，升陷湯治療冠心病主要涉及晚期糖基化終產物-晚期糖基化終產物受體(AGE-RAGE)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-AKT等幾個關鍵通路。

圖4 GO 生物過程(BP)分析

圖5 GO細胞組分(CC)分析

圖6 GO分子功能(MF)分析

圖7 KEGG分析

2.7 分子對接驗證 分別選取degree排名前5位的關鍵活性成分和核心靶點進行分子對接驗證。結果顯示：關鍵藥效物質與核心靶點的最低結合能均小于-5.0 kcal/mol(-20.9 kJ/mol)，25組中19組結合能小于-7.0 kcal/mol(-29.3 kJ/mol)，說明二者之間能夠穩定的結合[15]，詳見表3。結合能排在前10位的成分與靶點進行可視化分析，詳見圖8。

表3 關鍵藥效物質與核心靶點對接的Vina分數 單位：kcal/mol

3 討 論

升陷湯治療冠心病的臨床療效顯著，機制不甚明確，本研究利用網絡藥理學方法對其進行探索，結果顯示：從46個活性成分中篩選出槲皮素、山奈酚等5個關鍵活性成分，其中4個為黃酮類化合物；從158個交集靶點中篩選出STAT3、AKT1等5個關鍵靶點；通過KEGG富集分析篩選出AGE-RAGE等4個關鍵通路。升陷湯可能通過抗氧化應激、抗炎癥反應、抗細胞凋亡等多個機制發揮治療冠心病的作用。

3.1 關鍵活性成分分析 升陷湯治療冠心病的主要成分可能為槲皮素、山奈酚、木犀草素、7-O-甲基異丁香酚、異鼠李素等。其中，槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素均為黃酮類化合物。槲皮素可以抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化、抗血小板凝集、保護血管內皮，從而抑制冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展[16]；槲皮素還有非內皮依賴性舒張血管的作用，可以改善心肌缺血[17]。山奈酚能夠通過沉默調節因子1(SIRT1)介導的線粒體途徑，減輕缺氧/復氧對心肌細胞的損傷[18]；同時，山奈酚能減弱膠原蛋白誘導的血小板聚集和血小板依賴性血栓形成[19]。木犀草素通過Sp1上調肌漿網/內質網Ca2+-ATP酶-2a(SERCA2a)，以減輕小鼠的心肌缺血/再灌注損傷[20]。異鼠李素有抑制巨噬細胞凋亡以減緩動脈粥樣硬化斑塊發展的作用，其機制與PI3K-AKT通路的激活有關[21]。

3.2 關鍵靶點結果分析 根據degree值篩選出排名前5位的核心靶點：STAT3、AKT1、JUN、MAPK1、TP53。STAT3參與調控細胞生長、凋亡等進程，抑制其轉錄活性可減少內皮細胞的增殖、遷移和血管形成，從而延緩易損斑塊的進展[22]。AKT1參與調節細胞增殖和炎癥反應等過程，有研究表明，AKT1的激活可以抑制缺血缺氧導致的心肌細胞壞死[23]；同時，AKT1可以通過調節一氧化氮的生成，發揮舒張血管、保護心肌細胞的作用[24]。JUN轉錄因子通過調節染色質的可及性改變，激活基因表達程序，從而促進心肌細胞的去分化，增殖和突出進入受損區域，是心肌細胞應對損傷的重要調節因素[25]。MAPK1又稱ERK2基因，可促進血管內皮細胞增殖和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達，對于維持血管內皮的正常性和完整性有重要作用[26]；另有研究表明，ERK2可能通過抑制胰島素和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導的血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達，降低糖尿病動脈粥樣硬化的風險[27]。TP53作為一種轉錄因子，可以調節心肌素的表達，抑制TP53介導的心肌素表達從而抑制心肌細胞自噬，減輕心肌缺血/再灌注損傷[28]。

3.3 通路與生物進程分析 GO富集分析結果表明，升陷湯的作用靶點分布于多種細胞結構，以細胞膜上的結構最為顯著，這些結構與細胞內外物質轉運，特別是膽固醇的轉運相關。其中，膜脂質筏與胞內膽固醇流出細胞關系密切，有針對性地調節其功能有潛在的治療冠心病的效果[29]。升陷湯成分在蛋白質結構域特異性結合、蛋白激酶結合等分子層面發揮作用，并參與多個生物學過程，與機體應激、修復損傷以及細胞凋亡均有關，這與冠心病發病機制中的血管內皮細胞損傷、心肌細胞凋亡等病理、生理特點相契合。

KEGG富集結果顯示，升陷湯治療冠心病主要涉及以下幾個信號通路：AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路。AGEs可通過與其受體RAGE結合，引發氧化應激，并可通過激活核因子-κB(NF-κB)誘導炎癥反應和平滑肌增殖，從而造成血管內皮損傷和加速動脈粥樣硬化的發展[30]。P13K-AKT是調節細胞增殖的重要通路，激活P13K/AKT/eNOS信號傳導保護離體大鼠心臟免受再灌注損傷[31]。MAPK信號通路包括4個級聯反應，即p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)、JNK、ERK1/2和ERK5，主要通過調控細胞生長凋亡、調節氧化應激、炎癥反應等途徑影響動脈粥樣硬化的發展[32]。

3.4 升陷湯治療冠心病潛在機制分析 根據研究結果推測升陷湯可能通過以下3個機制治療冠心病。①抗炎癥反應：炎性因子的大量分泌是動脈粥樣硬化發生發展及斑塊破裂的重要機制。木犀草素可以通過抑制p38 MAPK途徑減少炎性因子的分泌，也可以通過抑制AKT磷酸化和降低JUN活性發揮抗炎作用。②抗氧化應激：氧化應激產生的ROS可以氧化脂質、蛋白質等大分子物質，并作為第二信使介導細胞信號的傳導，有多方面的致動脈粥樣硬化的作用。槲皮素、異鼠李素等黃酮類化合物是天然的抗氧化劑，可以清除體內的ROS，并抑制MAPK等介導氧化應激的通路，從而發揮抑制LDL氧化、抗血管內皮損傷、抗平滑肌增殖等作用，抑制動脈粥樣硬化斑塊發展。③抑制細胞凋亡：異鼠李素可以通過激活PI3K-AKT信號通路，抑制巨噬細胞凋亡，減緩動脈粥樣硬化斑塊的發展。

綜上所述，升陷湯可能主要通過黃酮類活性成分發揮抗冠心病的療效。升陷湯作用于冠心病發病的各個環節，可發揮抑制動脈粥樣硬化斑塊進展、抗血小板聚集、舒張血管、保護心肌細胞等多種功能。升陷湯可能主要通過抗氧化應激、抗炎癥反應、抑制細胞凋亡等途徑達到治療冠心病的作用。由于忽略了藥物劑量和煎服方式等因素對活性成分的影響，且數據庫對于成分和靶點預測存在不全面性，故網絡藥理學存在一定的局限性。本研究結果尚需進一步驗證，但無疑為進一步研究該方作用機制提供了線索和依據。