基于PINK1/Parkin通路研究槲皮素減輕血管性癡呆大鼠海馬神經元損傷的作用機制

唐 森，方 建，高立功，黃一葦

基于PINK1/Parkin通路研究槲皮素減輕血管性癡呆大鼠海馬神經元損傷的作用機制

唐 森1，方 建2，高立功1，黃一葦1

1. 駐馬店市中心醫院 神經內科，河南 駐馬店 463400 2. 河南大學第一附屬醫院 神經內科，河南 開封 475001

基于PTEN誘導激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/帕金蛋白（Parkin）通路研究槲皮素減輕血管性癡呆（vascular dementia，VD）大鼠海馬神經元損傷的作用機制。通過雙側頸總動脈永久性結扎法建立VD大鼠模型，分為模型組及槲皮素低、中、高（25、50、100 mg/kg）組和歐來寧（14.8 g/kg）組，另取12只大鼠作為假手術組，給予藥物干預21 d后，采用穿梭箱實驗評價大鼠學習記憶能力，比較各組大鼠步入潛伏期（step-through latency，STL）及在暗室中花費的總時間（total time spent in the dark chamber，TDC）；采用Nissl染色檢測大鼠海馬組織神經元損傷情況；采用透射電鏡觀察大鼠海馬區神經元超微結構；采用ELISA法檢測大鼠腦組織中乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）水平和血清中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-17、IL-1β水平；采用Western blotting檢測大鼠腦組織中自噬相關蛋白與PINK1/Parkin信號通路相關蛋白表達。與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織神經元損傷及超微結構受損嚴重，神經元內出現少量自噬體；STL顯著降低（＜0.05），TDC顯著升高（＜0.05）；腦組織中Ach和5-HT水平顯著降低（＜0.05），血清中IL-6、IL-17和IL-1β水平顯著升高（＜0.05）；腦組織中微管相關蛋白1輕鏈3 II（microtubule-associated protein 1 light 3 II，LC3II）/LC3I、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05）。與模型組比較，槲皮素組大鼠海馬組織神經元損傷及超微結構受損減輕，且神經元自噬現象增強；STL顯著升高（＜0.05），TDC顯著降低（＜0.05）；腦組織中Ach及5-HT水平顯著升高（＜0.05），血清中IL-6、IL-17和IL-1β水平均顯著降低（＜0.05）；腦組織中LC3II/LC3I、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05）。槲皮素可激活PINK1/Parkin信號通路，降低VD大鼠炎性細胞因子水平，減輕海馬神經元炎癥損傷，提高大鼠學習記憶能力，改善其癡呆癥狀。

槲皮素；血管性癡呆；海馬神經元損傷；自噬；PTEN誘導激酶1/帕金蛋白信號通路

血管性癡呆（vascular dementia，VD）屬于腦血管損傷引起的一種癡呆亞型，可造成記憶力減退、認知障礙、情感異常等臨床癥狀，是威脅中老年人健康并導致其癡呆的主要原因之一[1-2]。腦缺血缺氧是引發VD的常見病因，神經炎癥、自噬和細胞凋亡在VD病理過程中起到關鍵調控作用[3]，抑制炎癥、增強自噬作用可減輕神經元損傷，改善VD造成的認知障礙[4-5]。PTEN誘導激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/帕金蛋白（Parkin）是調節自噬的主要信號通路，可介導受損細胞器的清除和內環境平衡的維持過程，激活該信號可增強線粒體自噬，有益于炎癥性疾病的治療[6]，并可提升β-淀粉樣蛋白誘導的大鼠學習記憶能力，改善阿爾茨海默癥大鼠癡呆癥狀[7]。因此PINK1/Parkin可作為VD的潛在治療靶點。槲皮素是廣泛存在于銀杏、山楂和三七等眾多中藥中的黃酮類化合物，具有雌激素樣活性，可保護神經系統功能，改善阿爾茨海默癥患者癡呆癥狀[8-9]，并可促進PINK1和Parkin蛋白表達，拮抗神經炎癥，激活線粒體自噬，緩解大鼠腦缺血再灌注損傷[10]。本研究通過建立VD大鼠模型，探究槲皮素對VD誘導的大鼠海馬神經元損傷及PINK1/Parkin信號通路的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量200～240 g，購自康泰醫學檢驗服務河北有限公司，動物許可證號SYXK（冀）2021-006。動物于河南大學第一附屬醫院屏障環境動物房中喂養，溫度22～25 ℃，相對濕度50%～60%，明暗12 h交替循環。動物實驗經河南大學第一附屬醫院倫理委員會批準（批準號2022079）。

1.2 藥品與試劑

槲皮素（批號117395，質量分數為99%）購自美國Sigma公司；歐來寧膠囊（批號6916119040353，0.4 g/粒）購自石藥集團歐意藥業有限公司；大鼠5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）ELISA試劑盒（批號XY-SJH-DS1327）購自上海烜雅生物科技有限公司；大鼠乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）ELISA試劑盒（批號JL10299）購自上海江萊生物科技有限公司；Nissl染色液（批號C0117）、RIPA裂解液（批號P0013K）、BCA蛋白定量試劑盒（批號P0011）、大鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號PI328）、IL-1β ELISA試劑盒（批號PI303）均購自上海碧云天公司；IL-17 ELISA試劑盒（批號SEKR-0007）購自北京索萊寶科技有限公司；PINK1抗體（批號ab23707）、Parkin抗體（批號ab77924）、微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3）抗體（批號ab221794）、Beclin1抗體（批號ab62557）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號ab181602）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號ab150077）購自英國Abcam公司；HRP標記的山羊抗大鼠IgG抗體（批號A-11029）購自美國CST公司。

1.3 儀器

DCS-2型大鼠程控穿梭箱（中國醫學科學院藥物研究所）；HT7700型透射電鏡（TEM，日本日立公司）；ASP200S型全自動脫水機、G1150H型加熱石蠟包埋系統、DM3000型顯微鏡（德國Leica公司）；1510型石蠟切片機（德國SLEE公司）；RMC POWERTOME XL型超薄切片機（美國RMC公司）；1658033型小型垂直電泳轉印系統、15043型多功能酶標儀、Chemi-Doc XRS型化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 VD大鼠模型的建立、分組及給藥

參照文獻方法[11]制備VD大鼠模型，SD大鼠禁食不禁水12 h，ip 2.5%戊巴比妥納（45 mg/kg）麻醉，仰臥固定后頸部去毛、備皮、消毒，于正中切開，分離肌肉，鈍性分離雙側頸總動脈后結扎，縫合大鼠傷口即完成模型制備。1周后通過穿梭箱實驗篩選成模大鼠，與正常大鼠相比步入潛伏期（step-through latency，STL）顯著降低且暗室中花費的總時間（total time spent in the dark chamber，TDC）顯著升高即為造模成功，將其隨機分為模型組、歐來寧（14.8 g/kg）[11]組和槲皮素低、中、高劑量（25、50、100 mg/kg）[12]組，每組12只，另取12只大鼠只分離雙側頸總動脈不對其結扎，作為假手術組。各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg），假手術組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，1次/d，連續21 d。

2.2 穿梭箱實驗檢測大鼠學習記憶能力

給藥結束后，進行穿梭箱實驗檢測大鼠學習記憶能力[13]。穿梭箱系統由2個相同的空腔組成，1個有燈光刺激，處于照明狀態，1個保持黑暗。將大鼠放入光腔室中，并引導其自由穿梭于2個空腔室中5 min，當大鼠再次進入暗腔室中時，以0.5 mA的電流給予電擊刺激，直至大鼠逃至不通電的光腔室中，間隔5 min后重復同樣的操作，如此進行訓練1 d，使大鼠在5 min內不進入暗腔室；第2天，將大鼠置于光腔室中，以穿梭箱系統自帶的軟件記錄大鼠進入暗腔室中所需的時間，即STL，并記錄大鼠TDC，采用STL和TDC作為評價大鼠學習記憶能力的指標。

2.3 ELISA法檢測大鼠腦組織Ach、5-HT水平和血清IL-6、IL-17、IL-1β水平

穿梭箱實驗結束后，異氟醚麻醉大鼠，采集頸動脈血1.2 mL，4 ℃、1000 r/min離心15 min，取上清，于?80 ℃保存備用；然后斷頭處死大鼠，解剖取出大腦，取0.7 g腦組織，加入高效RIPA裂解液勻漿，4 ℃、3000 r/min離心20 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，于?80 ℃保存備用。取腦組織蛋白樣品液和血清于冰水浴中解凍，吸取0.2 mL腦組織蛋白樣品液和0.3 mL血清，按照ELISA試劑盒說明書測定腦組織Ach、5-HT水平和血清IL-6、IL-17、IL-1β水平。

2.4 Nissl染色檢測大鼠海馬組織神經元損傷

取各組大鼠腦組織，于10%福爾馬林中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后冠狀切片，取含有典型海馬組織結構的切片，經脫蠟、水化后，浸入Nissl染色液中進行染色、漂洗，以中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照，神經細胞中的尼氏小體可被染為藍紫色，正常神經元細胞尼氏小體數量多、染色較深且均勻，當其細胞受損時，尼氏小體染色較淺，數量大量減少。

2.5 TEM觀察大鼠海馬區神經元超微結構

取“2.4”項下各組含有典型海馬組織結構的切片，脫蠟、水化后，于1%鋨酸中固定，脫水，環氧樹脂包埋，使用超薄切片機切片（厚度50～100 nm），于TEM下觀察各組神經元超微結構，采集圖像并評測自噬情況。

2.6 Western blotting檢測大鼠腦組織PINK1/Parkin信號通路相關蛋白表達

取“2.3”項下各組腦組織蛋白樣品液，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉2 h，分別加入PINK1、Parkin、LC3、Beclin1和GAPDH抗體，4 ℃孵育13 h；TBST洗滌3次，5 min/次，加入相應二抗，37.5 ℃孵育75 min；TBST洗滌3次，5 min/次，通過化學發光法顯影后拍照，以Quantity One軟件定量各條帶灰度值。

2.7 統計學分析

實驗數據采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，兩組間差異比較使用檢驗；多組間差異比較進行單因素方差分析，進一步兩兩比較使用LSD-檢驗。

3 結果

3.1 槲皮素對VD大鼠學習記憶能力的影響

如表1所示，與假手術組比較，模型組大鼠STL顯著降低（＜0.05），TDC顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠STL均顯著升高（＜0.05），TDC均顯著降低（＜0.05），且呈劑量相關性。

表1 各組大鼠STL和TDC(, n = 12)

Table 1 STL and TDC of rats in each group (, n = 12)

組別劑量/(mg·kg?1)STL/sTDC/s 假手術—267.18±21.7319.13±2.07 模型—140.32±8.25#114.64±9.21# 槲皮素25178.95±10.84*82.56±6.35* 50220.34±13.12*57.02±5.10* 100260.46±15.81*23.04±4.24* 歐來寧14 800261.95±14.09*22.38±5.02*

與假手術組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05，下表同

#< 0.05sham operation group;*< 0.05model group, same as below tables

3.2 槲皮素對VD大鼠海馬神經元損傷的影響

如圖1所示，假手術組大鼠海馬神經元細胞尼氏小體數量眾多，排列規整，染色深且均勻。模型組大鼠海馬神經元細胞尼氏小體數量大量減少，排列紊亂，染色較淺，細胞損傷嚴重。與模型組比較，各給藥組大鼠海馬神經元細胞狀態均有好轉，尼氏小體數量增加，呈劑量相關性，槲皮素高劑量組和歐來寧組大鼠海馬神經元細胞好轉、恢復程度最強，與假手術組大鼠海馬神經元細胞狀態相當。

3.3 槲皮素對VD大鼠海馬神經元自噬的影響

如圖2所示，假手術組大鼠海馬區神經元超微結構清晰，完整無損，線粒體外膜完整，整體呈長桿狀或橢圓形，核膜完好無異常，未見明顯自噬體。模型組大鼠海馬區神經元超微結構受損，核周染色質聚集增多，線粒體固縮且數量減少，有少量自噬體產生，出現自噬現象。與模型組比較，各給藥組大鼠海馬區神經元超微結構受損減輕，核周染色質聚集減少，線粒體形態及數量有不同程度恢復，自噬體均增多，自噬現象增強，且隨著槲皮素劑量升高，上述改變增強，槲皮素高劑量組和歐來寧組大鼠海馬區神經元超微結構恢復及自噬情況相當。

3.4 槲皮素對VD大鼠腦組織Ach和5-HT水平的影響

如表2所示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中Ach和5-HT水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中Ach和5-HT水平均顯著升高（＜0.05），且呈劑量相關性。

表2 各組大鼠腦組織Ach和5-HT水平(, n = 12)

Table 2 Ach and 5-HT levels in brain tissue of rats in each group (, n = 12)

組別劑量/(mg·kg?1)Ach/(pmol·L?1)5-HT/(ng·L?1) 假手術—402.76±29.03597.86±30.12 模型—265.64±10.59#301.72±11.38# 槲皮素25306.47±13.91*397.43±14.06* 50349.86±15.14*498.59±17.45* 100493.78±24.50*590.05±20.83* 歐來寧14 800495.85±21.62*593.17±19.39*

3.5 槲皮素對VD大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-17和IL-1β含量的影響

如表3所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-17和IL-1β水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-6、IL-17和IL-1β水平均顯著降低（＜0.05），且呈劑量相關性。

表3 各組大鼠血清中IL-6、IL-17和IL-1β水平(, n = 12)

Table 3 IL-6, IL-17 and IL-1β levels in serum of rats in each group (, n = 12)

組別劑量/(mg·kg?1)IL-6/(pg·mL?1)IL-17/(pg·mL?1)IL-1β/(pg·mL?1) 假手術—21.47±3.3647.96±5.12212.87±40.32 模型—98.62±10.13#187.32±12.43#908.16±58.73# 槲皮素2571.56±6.74*142.18±8.56*681.64±49.15* 5052.72±5.92*98.75±6.72*458.21±37.62* 10024.01±5.01*50.02±4.85*234.05±27.86* 歐來寧14 80023.12±4.85*49.03±3.63*230.19±26.78*

3.6 槲皮素對VD大鼠腦組織自噬相關蛋白表達的影響

如圖3所示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中自噬相關蛋白Beclin1和LC3II/LC3I表達水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中Beclin1和LC3II/LC3I表達水平進一步顯著升高（＜0.05），且呈劑量相關性。

3.7 槲皮素對VD大鼠腦組織PINK1/Parkin信號通路蛋白表達的影響

如圖4所示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中PINK1和Parkin蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中PINK1和Parkin蛋白表達水平均進一步顯著升高（＜0.05），且呈劑量相關性。

4 討論

隨著我國人口老齡化的加重，VD患病率逐年升高，極大削弱了患者的工作及自主生活能力，因看護和治療花費大，給家庭造成沉重負擔，已成為亟需解決的公共醫療衛生問題[14-15]。本研究以雙側頸總動脈永久性結扎法建立VD大鼠模型，可明顯升高血清中炎性因子IL-6、IL-17和IL-1β水平，誘發并放大神經炎癥，造成大鼠海馬組織神經元嚴重損傷，且大鼠腦內與學習記憶能力密切相關的Ach[12]和神經遞質5-HT[15]水平均顯著降低，穿梭箱實驗大鼠進入暗腔室中所需的時間顯著降低，在暗室中停留更久，表明大鼠的學習記憶功能明顯受損，出現認知障礙，說明VD大鼠模型構建成功。

與假手術組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05，圖4同

圖4 各組大鼠腦組織中PINK1和Parkin蛋白表達情況(, n = 12)

研究發現，腦灌注不足引發的強烈炎癥是VD的主要病理基礎，另外自噬作用在其中也發揮著至關重要的作用[3,16]，促進自噬、減輕神經元炎癥損傷是治療VD的有效手段[16-17]。槲皮素作為一種天然黃酮化合物，可降低炎性因子表達，減少神經細胞凋亡，增強自噬活性，減輕腦缺血再灌注損傷[9,18]，并可通過抑制創傷性腦損傷后神經炎癥，從而發揮顯著的腦保護作用[19]。本研究結果顯示，VD模型大鼠海馬神經元內出現少量自噬體，腦組織中LC3II/LC3I及Beclin1蛋白表達升高，表明VD模型大鼠神經元自噬代償性增強，會對神經元起到保護作用，但神經元損傷及超微結構受損嚴重，揭示VD模型大鼠神經元的自噬代償性增強并不足以對抗其損傷，而以不同劑量的槲皮素干預VD大鼠，可降低大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-17和IL-1β水平，抑制炎癥發生，提高自噬蛋白Beclin1及LC3II/LC3I表達，減輕海馬組織神經元損傷及超微結構受損情況，增加神經元自噬體數量及穿梭箱實驗中大鼠進入暗腔室中所需時間，升高腦組織Ach及5-HT水平，并減少大鼠在暗室中停留時間，且呈劑量相關性，揭示槲皮素不僅可減弱神經炎癥，還可增強神經元自噬，從而緩解海馬神經損傷，回復大鼠的學習記憶功能，發揮神經保護作用。

研究顯示，PINK1/Parkin信號通路可通過調節線粒體自噬介導唐氏綜合征、阿爾茨海默癥等疾病的病理過程，上調通路蛋白PINK1、Parkin表達可明顯增強細胞自噬活性，加快清除受損線粒體，減輕細胞氧化應激損傷[20]；過表達PINK1可激活自噬信號，抑制活性氧產生，改善線粒體功能障礙，緩解神經元損傷，從而改善阿爾茨海默癥患者癡呆癥狀[21]，由此可見PINK1/Parkin信號可通過促進自噬減輕細胞損傷，進而推測槲皮素可能通過上調PINK1/Parkin信號通路而增強自噬，從而減輕血管性癡呆大鼠海馬神經元損傷。本研究結果顯示，VD大鼠腦組織中PINK1和Parkin蛋白表達升高，而經槲皮素處理后，兩者表達進一步升高，表明PINK1/Parkin信號介導VD的病理過程，在VD發病過程中，PINK1/Parkin信號有所激活，激活自噬作用，對永久性結扎大鼠雙側頸總動脈后所引發的腦損傷有一定抵抗作用，但功效不強，而槲皮素不僅可抑制神經炎癥，還可激活PINK1/Parkin信號，促進自噬，進一步增強細胞自噬對腦損傷的抵抗作用，最終達到改善大鼠學習記憶功能、減輕癡呆癥狀的作用。

綜上所述，槲皮素可上調PINK1、Parkin蛋白表達，抑制炎性細胞因子合成和釋放，緩解海馬神經元炎癥損傷，促進自噬，改善VD大鼠學習記憶功能，緩解其癡呆癥狀，激活PINK1/Parkin信號可能是其發揮以上作用的機制之一。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mchanism of quercetin on alleviating hippocampal neuron injury in vascular dementia rats based on PINK1/Parkin pathway

TANG Sen1, FANG Jian2, GAO Li-gong1, HUANG Yi-wei1

1. Department of Neurology, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463400, China 2. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, China

To explore the mechanism of quercetin on alleviating hippocampal neuron damage in vascular dementia (VD) rats based on PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1)/Parkin signaling pathway.VD rat model was established by permanent ligation of bilateral common carotid arteries, and were divided into model group, quercetin low-, medium-and high-dose (25, 50, 100 mg/kg) groups, and oxiracetam (14.8 g/kg) groups, and another 12 rats were selected as sham-operated group. After 21 d of drug intervention, shuttle box experiment was used to evaluate the learning and memory ability of rats, step-through latency (STL) and total time spent in the dark chamber (TDC) of rats in each group were compared; Nissl staining was used to detect neuronal damage in hippocampus of rats; Transmission electron microscope was used to detect the ultrastructural observation of neurons in rat hippocampus; ELISA was used to detect acetylcholine (Ach) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) levels in brain tissue, and interleukin-6 (IL-6), IL-17, and IL-1β levels in serum; Western blotting was used to detect expressions of autophagy-related proteins and PINK1/Parkin signaling pathway related proteins in brain tissues of rats in each group.Compared with sham operation group, neurons and ultrastructure of hippocampus in model group were seriously damaged, a small number of autophagosomes appear in neurons; STL was significantly decreased (< 0.05), and TDC was significantly increased (< 0.05); Levels of Ach and 5-HT in brain tissue were significantly decreased (< 0.05), levels of IL-6, IL-17 and IL-1β in serum were significantly increased (< 0.05); Microtubule-associated protein 1 light 3 II (LC3II)/LC3I, Beclin1, PINK1 and Parkin protein expression levels in brain tissue were significantly increased (< 0.05). Compared with model group, neuronal damage and ultrastructural damage in hippocampus of rats in quercetin group were alleviated, and autophagy of neurons was enhanced; STL was significantly increased (< 0.05), and TDC was significantly decreased (< 0.05); Levels of Ach and 5-HT in brain tissue were significantly increased (< 0.05), levels of IL-6, IL-17 and IL-1β in serum were significantly decreased (< 0.05); LC3II/LC3I, Beclin1, PINK1 and Parkin protein expression levels in brain tissue were significantly increased (< 0.05).Quercetin can activate PINK1/Parkin signaling pathway, reduce inflammatory cytokines levels in VD rats, alleviate the inflammatory damage of hippocampal neurons, improve the learning and memory ability of rats, and improve the symptoms of dementia.

quercetin; vascular dementia; hippocampal neuron injury; autophagy; PTEN-induced putative kinase 1/Parkin signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6529 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.025

2022-06-06

河南省醫學科技攻關計劃聯合共建項目（LHGJ20210555）

唐 森，碩士，主治醫師，主要從事腦血管病、癡呆的診治。Tel: 15836706647 E-mail: tangsen2244@163.com

[責任編輯 李亞楠]